一、實(shí)驗(yàn)材料

1，RNA待測(cè)樣本（注：本人用的是直接提取的RNA，為了實(shí)驗(yàn)更嚴(yán)謹(jǐn)，應(yīng)當(dāng)先進(jìn)行mRNA純化）

2，無酶水

3，TBST（1×TBS， 0.1%Tween-20）

4，封閉液

5，一抗

6，二抗

7，ECL顯影液

8，亞甲藍(lán)染色緩沖液（0.4M醋酸鈉、0.4M醋酸中的0.2%亞甲藍(lán)）

二，實(shí)驗(yàn)設(shè)備

無酶EP管

加熱設(shè)備

NC膜 或 帶正電荷的尼龍膜（建議使用尼龍膜，專門用來做核酸交聯(lián)，效果比NC膜好）

干凈的塑料盒或者培養(yǎng)皿

烘箱或者帶有254nm燈泡的交聯(lián)設(shè)備（可用紫外線消毒燈代替，1m范圍內(nèi)有效）

顯影設(shè)備

三，流程

1，取出待測(cè)RNA樣本，解凍后測(cè)量RNA濃度，全程冰上操作。

2，將樣品濃度統(tǒng)一，并在新的無酶管連續(xù)稀釋樣品并混勻，稀釋梯度不固定，可自己試試最好效果。我選擇的終濃度為400/200/100 ng/μL 。

3，離心后，將RNA樣品95℃加熱3分鐘以破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)束后立即冰上冷卻，防止重新形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。

4，用1ml槍頭粗端在NC膜上留下圓形印記，以引導(dǎo)加樣，隨后將NC膜裁剪成合適的尺寸，轉(zhuǎn)移至干凈的塑料盒中。

5，將2μl RNA樣品按順序滴在NC膜上，注意槍頭不要碰膜，樣品應(yīng)在膜上自然擴(kuò)散，每次加樣都需要更換槍頭。

6，室溫下NC膜上稍干燥后可進(jìn)行RNA與膜的交聯(lián)。方法一：37℃烘箱 30min。方法二：254nm波長(zhǎng)的紫外線燈下照射30min-1h。

7，10ml TBST清洗膜5min，洗去未結(jié)合的RNA。

8，棄去TBST，加入10ml封閉液，室溫?fù)u動(dòng)孵育1小時(shí)。

9，棄去封閉液，加入含有一抗的封閉液4℃孵育過夜。

10,10ml TBST清洗膜3次，每次10min。

11，二抗室溫孵育1小時(shí)。

12，同第10步。

13，ECL底物孵育5min

14，顯影儀下拍照

15，拍完照后，將膜放置于10ml亞甲藍(lán)染色緩沖液中，室溫?fù)u動(dòng)孵育30min

16，用ddH2O清洗至背景大致干凈即可，約30-60s

17，白光成像采集亞甲藍(lán)染色后的圖像作為負(fù)載對(duì)照。