實(shí)驗(yàn)原理

慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。

慢病毒包裝質(zhì)粒可提供轉(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的輔助蛋白。

1. 外殼糖蛋白 識(shí)別并感染宿主細(xì)胞
2. 結(jié)構(gòu)蛋白 病毒復(fù)制所需要的酶

試驗(yàn)流程

1.細(xì)胞準(zhǔn)備

HEK-293T細(xì)胞提前一天鋪板，每10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿接種3~5×106cells，置于37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h～24h后，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度80%左右。

注意：細(xì)胞消化要充分，成團(tuán)生長(zhǎng)的細(xì)胞會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞狀態(tài)對(duì)于病毒包裝至關(guān)重要，保證細(xì)胞良好狀態(tài)（實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素），無(wú)支原體污染。

2. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（4-5天）

將包裝質(zhì)粒和 GFP Control Plasmid（或陰性對(duì)照質(zhì)粒或目的基因慢病毒載體質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染入 293T 包裝細(xì)胞中。

以下操作均以 10cm dish，轉(zhuǎn)染試劑采用simple fect為例，其他轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒用量需根據(jù)培養(yǎng)器皿的規(guī)格進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。

（1）轉(zhuǎn)染前1~2h 將需要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更換新鮮的培養(yǎng)基（DMEM+5% FBS），8mL/10cm皿。

（2）按下表配制轉(zhuǎn)染體系，吹打混勻。（三質(zhì)粒比例4:3:1）

（3）按照DNA：simple fect=1:2.5的比例將轉(zhuǎn)染試劑(12+9+3)×2.5=60ul，加入并吹打混勻，室溫靜置20min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。

（4）取轉(zhuǎn)染復(fù)合物，逐滴添加到培養(yǎng)皿中，呈“十”或“8”字形輕輕搖晃混勻。

（5）轉(zhuǎn)染6-8h后更換7 ml不含雙抗的新鮮培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS）。（此時(shí)棄去的培養(yǎng)基中已含有少量的病毒，廢液以及所用的移液槍頭必須經(jīng)處理后才能丟棄）

（6）換液后48h，用移液槍從培養(yǎng)皿的一側(cè)收集上清液到15mL離心管，3000 r/min離心5 min并用0.45mm濾膜過(guò)濾去除死細(xì)胞，過(guò)濾后的細(xì)胞上清液如果暫時(shí)不進(jìn)行進(jìn)一步處理，可分裝后置于-80℃冰箱保存。

注意：通常細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后就可以看到熒光蛋白的表達(dá)，293T 細(xì)胞會(huì)明顯的皺縮成圓形，48h可以進(jìn)行熒光照片的采集，判斷轉(zhuǎn)染效率。

一般為了能獲得高滴度的病毒，需要通過(guò)不斷優(yōu)化條件，提高轉(zhuǎn)染效率。優(yōu)化條件包括：細(xì)胞培養(yǎng)條件，轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)化，三質(zhì)粒比例的優(yōu)化（1:1:1）等

3.慢病毒的濃縮與純化（提高病毒滴度和純度）

采用PEG8000方法濃縮病毒

（1）5× PEG8000 -NaCl配制：稱取NaCl 8.766 g; PEG8000 50 g溶解在200 mL純水中；121 ℃ 30 min 濕熱滅菌 ；保存在4℃；

（2）每30ml過(guò)濾后的粗病毒液，加入5× PEG8000 -NaCl母液7.5 mL；

（3）每20～30min混合一次，共進(jìn)行3-5次，4℃放置過(guò)夜；

（4）4℃，4000 g，離心 20min；（離心后可以直接看到病毒沉淀）

（5）吸棄上清，靜置管子1～2min，吸走殘余液體；（吸走液體時(shí)要小心，不要吸走了沉淀）

（6）加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；（PBS溶液或培養(yǎng)基）

（7）溶解后的病毒懸液分裝成小份，保存于-80 ℃，避免反復(fù)凍融。（凍融一次，滴度下降10%左右）

4.滴度測(cè)定

熒光計(jì)數(shù)法，耗時(shí)5天。

（1）測(cè)定前一天，將HEK-293T細(xì)胞鋪板，96 孔板，每孔加 5×104個(gè)細(xì)胞，體積為 100μL；

（2）在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)10個(gè)稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準(zhǔn)備10個(gè)1.5ml EP管，每管加入900μl培養(yǎng)液，往第一個(gè)管中加入100μl病毒原液，混勻后，吸取100μl加入第二個(gè)管混勻。依此類推，做十個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度可做3個(gè)重復(fù)孔；

（3）選取所需的細(xì)胞孔，吸去培養(yǎng)基。加入 100μl 稀釋好的病毒溶液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；

（4）棄去帶病毒的培養(yǎng)液，每孔加不含雙抗的完全培養(yǎng)基；

（5）48h后觀察熒光，應(yīng)有初步表達(dá)；72h后觀察熒光，計(jì)算滴度。

滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量。比如在加入 10-6 μl 病毒原液的孔中觀察到2 個(gè)帶有熒光的細(xì)胞，就是 2/（10-6）=2E+6，單位為 TU/μl，也就等于 2E+9 TU/ml

5.感染目的細(xì)胞 （耗時(shí)3-4天）

（1）細(xì)胞鋪板 將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞接種到6 孔板，接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長(zhǎng)速度而略有不同，一般是保證第二天進(jìn)行病毒感染的時(shí)候細(xì)胞匯合率介于 50%至 70%；

（2）病毒感染 更換不含雙抗的新鮮培養(yǎng)基2mL，從冰箱取出并在 37℃水浴中快速融化病毒并根據(jù)最佳MOI計(jì)算所需病毒液體積加入六孔板中（一般實(shí)驗(yàn)操作采用粗病毒液半體積感染），每孔加入終濃度為8μg/ml polybrene；

（3）24h后更換不含雙抗的新鮮培養(yǎng)基2mL；

（4）48h后觀察熒光。（代謝比較緩慢的細(xì)胞GFP表達(dá)所需時(shí)間較長(zhǎng)，72h可以觀察到熒光）

注意：感染后期請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的情況對(duì)細(xì)胞進(jìn)行及時(shí)換液和傳代，以保證細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)

①Polybrene（聚凝胺）:是帶正電的小分子，與細(xì)胞表面的陰離子結(jié)合，提高慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率，通常加入 polybrene 能提高感染效率 2～10 倍。

Polybrene 有一定的細(xì)胞毒性，有的細(xì)胞對(duì) polybrene 的毒理反應(yīng)明顯，因此細(xì)胞感染時(shí)是否適合 polybrene 需要摸索；不同細(xì)胞對(duì) polybrene 的敏感度不同，可以用 1～10μg/ml 的范圍篩選合適的濃度，以 24h 內(nèi)細(xì)胞無(wú)明顯毒性反應(yīng)為佳，可參考文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，polybrene 最常用的工作濃度為 6～8μg/ml。

②感染細(xì)胞最佳 MOI 的確定

MOI（multiplicity of infectin）感染復(fù)數(shù)，含義為每個(gè)細(xì)胞被多少個(gè)有活力病毒所感染。在實(shí)驗(yàn)中將某個(gè)細(xì)胞達(dá)到 80%感染時(shí)所需的 MOI 值定義為這個(gè)細(xì)胞的 MOI 值。相關(guān)文獻(xiàn)支持或感染預(yù)實(shí)驗(yàn) 需要的病毒體積=（MOI×細(xì)胞數(shù)）/病毒滴度

6.加壓篩選（7天左右）

根據(jù)包裝的慢病毒載體上的篩選抗生素，進(jìn)行加壓篩選，這里以嘌呤霉素為例

（1）每 2-3 天換含 puromycin 的完全培養(yǎng)液一次，至不感染篩選對(duì)照組細(xì)胞被 puromycin

殺光。 western blot 或者 qPCR 檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)效率。

（2）可進(jìn)行以下兩步操作（依照具體實(shí)驗(yàn)需要選擇）

①不挑取單克隆：將感染并篩選后的細(xì)胞進(jìn)行傳代，并繼續(xù)施加低濃度 puromycin 進(jìn)行維持性篩選培養(yǎng)。連續(xù)篩選并傳 3 代后，凍存穩(wěn)定細(xì)胞株。

②挑取單克?。褐苽浼?xì)胞懸液，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10μl，接種到96孔板中，會(huì)有一部分孔中只有單個(gè)細(xì)胞，對(duì)其擴(kuò)大培養(yǎng)，western blot 或者 QPCR 檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)效率。

注意：

①不同細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素的敏感程度也不一樣，所以需要設(shè)濃度梯度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)驗(yàn)是從1μg/ml到10μg/ml或者參考文獻(xiàn)去設(shè)立3-5個(gè)濃度梯度；

②再培養(yǎng)24-48h后觀察細(xì)胞的死亡情況，選擇最佳的嘌呤霉素濃度孔細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

③嘌呤霉素最佳濃度的確定：首先是未感染的正常細(xì)胞必須全部死亡，其次就是根據(jù)各孔細(xì)胞死亡情況來(lái)確定，一般選擇死亡超過(guò)50%，細(xì)胞生長(zhǎng)速度較其它孔不會(huì)明顯降低。因?yàn)榧?xì)胞死亡少的話可能會(huì)有很多低表達(dá)量的細(xì)胞存在，如果細(xì)胞死亡過(guò)多，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞擴(kuò)增很慢，不利于快速獲得穩(wěn)定細(xì)胞株；

④選擇了最佳的嘌呤霉素濃度，不代表后面一直用這個(gè)濃度，要根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況來(lái)判斷，適當(dāng)?shù)娜ピ鰷p嘌呤霉素的濃度。