一、原理
在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上,用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線,去除中央部分的細(xì)胞,然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實驗設(shè)定的時間,取出細(xì)胞培養(yǎng)板,在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細(xì)胞的生長遷移能力。
通過不同分組之間的細(xì)胞對于劃痕區(qū)修復(fù)能力的不同,可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力的差別。
二、步驟
1、準(zhǔn)備:
所有能滅菌的器械都要滅菌,直尺和 marker 筆在操作前紫外照射 30 min(超凈臺內(nèi))
2、流程:
1. 培養(yǎng)板劃線:先用 marker 筆在 6 孔板背后,用直尺比著,均勻得劃橫線,大約每隔 0.5~1 cm 一道,橫穿過孔,每孔至少穿過 5 條線;
2. 鋪細(xì)胞:在孔中加入約 5×105 個細(xì)胞,具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同,掌握為過夜能鋪滿;
3. 細(xì)胞劃線:第二天用槍頭比著直尺,盡量垂至于背后的橫線劃痕,槍頭要垂直,不能傾斜;
4. 洗細(xì)胞:用 PBS 洗細(xì)胞 3 次,去除劃下的細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基;
5. 細(xì)胞培養(yǎng)及觀察:放入 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱,培養(yǎng);按 0,6,12,24 小時取樣,倒置顯微鏡觀察特定位置細(xì)胞遷移情況并拍照;
6. 結(jié)果分析:使用 Image J 軟件打開圖片后,隨機劃取 6-8 條水平線,計算細(xì)胞間距離的均值。
三、注意事項
1、鋪細(xì)胞最好使用 6 孔板,因為 6 孔板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕,而且因為有 5 條定位線,與劃痕相交,這樣就有10 個可固定監(jiān)測點,不作重復(fù),誤差也很小。
2、如果你連續(xù)監(jiān)測 24 小時,你需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁殖共同作用的結(jié)果,而不是單純的細(xì)胞遷移。
如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移,你可以先用絲裂霉素(1 ug/ml)處理一小時,抑制細(xì)胞的分裂,這樣你的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。另外,使用無血清培養(yǎng)基也可以降低增殖對實驗結(jié)果的影響。
3、照片拍完之后,可以用 ImageJ 來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。
4、雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響,但是由于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié),細(xì)胞遷移的速度也會慢很多。
5、應(yīng)盡量清洗掉散落的細(xì)胞,對于一些細(xì)胞,低血清濃度下也能重新貼壁并增殖,此外也影響數(shù)據(jù)美觀。
四、常見問題
1.劃痕法測量適用的細(xì)胞范圍較小,一般只適用于上皮細(xì)胞,纖維樣細(xì)胞。
2.雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響,但是由于細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié),細(xì)胞遷移的速度也會慢很多。
3、在用 PBS 緩沖液沖洗時,注意貼壁慢慢加入,以免沖散單層貼壁細(xì)胞,影響實驗拍照結(jié)果。
4、一般做劃痕實驗,需要排除細(xì)胞增殖的影響,一般在不影響細(xì)胞增殖的情況下采用低血清(<2%)或者無血清,否則細(xì)胞增殖就不能忽略,這樣對于遷移較慢的細(xì)胞就需要延長拍攝時間(也可用絲裂酶處理一小時)。
5、按照 6 孔板背后畫線的垂直方向劃痕,可以形成若干交叉點,作為固定的檢測點,以解決了前后觀察時位置不固定的問題。
6、每次拍照前、后,盡量換掉培養(yǎng)基,去除飄落的細(xì)胞,能得到較為干凈的劃痕區(qū)域。
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