腫瘤細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)在腫瘤學(xué)（遷移、侵襲）和免疫學(xué)（遷移、趨化）中是常規(guī)實(shí)驗(yàn)。侵襲是細(xì)胞遷移的一種。細(xì)胞遷移分三種類型：趨觸、趨化和侵襲。腫瘤細(xì)胞的侵襲性是腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、藥物治療、靶向治療、致癌/抑癌基因等腫瘤學(xué)研究的一個(gè)重要指標(biāo)。

為了對(duì)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有更加清晰的理解，我們先來(lái)了解一下，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過(guò)程，主要包括以下5個(gè)過(guò)程：原位侵襲，腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲，循環(huán)系統(tǒng)存活，腫瘤細(xì)胞外滲，形成轉(zhuǎn)移灶等。其中細(xì)胞侵襲便發(fā)生在第一步，即腫瘤細(xì)胞在原位突破基底膜，然后內(nèi)滲進(jìn)入血管、淋巴管的過(guò)程，后期才開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)移。

實(shí)驗(yàn)原理

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，并將高營(yíng)養(yǎng)液與低營(yíng)養(yǎng)液用一層膜隔開(kāi)，并在膜上室鋪基質(zhì)膠，用來(lái)模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。腫瘤細(xì)胞放在低營(yíng)養(yǎng)液中，為了獲得更多的營(yíng)養(yǎng)吃的更飽，這些細(xì)胞需先分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，才能穿過(guò)這層膜，進(jìn)入高營(yíng)養(yǎng)液，最后通過(guò)計(jì)數(shù)下室的細(xì)胞量即可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

實(shí)驗(yàn)方法

1、復(fù)蘇代數(shù)靠前的腫瘤細(xì)胞，在含有10% FBS的培養(yǎng)基中預(yù)先培養(yǎng)2-3代，待細(xì)胞匯合達(dá)到80%左右，饑餓處理18-24小時(shí)。

2、準(zhǔn)備鋪膠：

a）4 °C溶matirgel膠過(guò)夜

b）將細(xì)胞小室、培養(yǎng)板和槍頭等于4°C 預(yù)冷

c）用無(wú)血清的冷培養(yǎng)基稀釋matirgel膠至一定濃度，加入到細(xì)胞小室的上層（按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的推薦比例和體積），輕輕搖晃使膠均勻鋪在膜上。以上操作在冰上進(jìn)行

d）立即將鋪好matrigel膠的細(xì)胞小室置于培養(yǎng)板中，于37°C孵育1小時(shí)左右，matirgel膠可由液體凝成固體，吸走多余的或者未凝的膠

3、細(xì)胞用PBS清洗一次，胰酶消化，然后用包含5% BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基中和，1500rpm離心5-10min。

4、用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度

5、取上述細(xì)胞液加入小室，下室（培養(yǎng)板）加入含有10% FBS的培養(yǎng)基。不同規(guī)格的小室和培養(yǎng)板所加的體積不同，具體參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

6、37 °C孵育24至72小時(shí)，依據(jù)腫瘤細(xì)胞類型而定

7、孵育結(jié)束，小心取出細(xì)胞小室，吸掉小室上層培養(yǎng)液，PBS清洗一遍，70%酒精或者4%多聚甲醛固定5min，0.5%結(jié)晶紫（2%乙醇或PBS溶解）染色20min，然后進(jìn)行第8步或者第9步。

8、PBS清洗兩次以去除多余的染料，立即用棉簽擦去濾膜上層的細(xì)胞，自然靜置風(fēng)干。顯微鏡下觀察濾膜下層的細(xì)胞，隨機(jī)選取不同的視野計(jì)數(shù)并算平均值。

9、結(jié)晶紫溶解濾膜下層細(xì)胞，然后用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來(lái)，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570nm讀取OD值。這種方法可以避免視野下細(xì)胞穿透不均勻帶來(lái)的誤差。

10、計(jì)數(shù)：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析有兩種方法

直接計(jì)數(shù)法：通過(guò)給細(xì)胞染色，直接在鏡下計(jì)數(shù)。選擇不同的視野拍照（一般選擇呈現(xiàn)視野中穿過(guò)的細(xì)胞），計(jì)數(shù)的結(jié)果可做成統(tǒng)計(jì)圖，輔助呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。

間接計(jì)數(shù)法：主要用于穿過(guò)細(xì)胞過(guò)多，而無(wú)法通過(guò)計(jì)數(shù)獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)所采用的方法，與常用的MTT實(shí)驗(yàn)是同樣的原理。它包括：MTT法、 熒光試劑檢測(cè)、 結(jié)晶紫檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

1、腫瘤細(xì)胞最好經(jīng)過(guò)饑餓處理，并且小室上下培養(yǎng)基的FBS有濃度差，以保證細(xì)胞可以穿透基質(zhì)膠。

2、鋪細(xì)胞要均勻，濾膜底部不能產(chǎn)生氣泡，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞染色不均勻，或者局部細(xì)胞無(wú)法穿透。

3、侵襲實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞密度比較大，不同腫瘤細(xì)胞的接種密度、培養(yǎng)時(shí)間不同，需要實(shí)驗(yàn)摸索。細(xì)胞太少，遷移不過(guò)去；細(xì)胞太多，可能導(dǎo)致正常組和實(shí)驗(yàn)組無(wú)差異。

4、首次做實(shí)驗(yàn)需要用正常的細(xì)胞摸索合適的細(xì)胞密度和培養(yǎng)時(shí)間，確定之后再加實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)如果條件允許，設(shè)置一組已知高遷移性的細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照。

5、注意細(xì)胞小室內(nèi)外培養(yǎng)基的比例，不要使小室外培養(yǎng)基超過(guò)小室內(nèi)培養(yǎng)基液面。

6、觀察細(xì)胞時(shí)一定要擦去小室內(nèi)部貼在膜上的細(xì)胞。