傳統(tǒng)的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內(nèi)肽的化學(xué)測(cè)序、已知或未知蛋白comigration分析，或者在一個(gè)有機(jī)體中有意義的基因的過(guò)表達(dá)通常耗時(shí)、耗力，不適合高流通量的篩選。所選用的技術(shù)包括對(duì)于蛋白鑒定的圖象分析、微量測(cè)序、進(jìn)一步對(duì)肽片段進(jìn)行鑒定的氨基酸組分分析和與質(zhì)譜相關(guān)的技術(shù)。

  圖象分析技術(shù)

  “滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺(jué)，每一個(gè)圖象上斑點(diǎn)的上調(diào)、下調(diào)及出現(xiàn)、消失，都可能在生理和病理狀態(tài)下產(chǎn)生，必須依靠計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行定量分析。在一系列高質(zhì)量的2-DE凝膠產(chǎn)生(低背景染色，高度的重復(fù)性)的前提下，圖象分析包括斑點(diǎn)檢測(cè)、背景消減、斑點(diǎn)配比和數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建。

  首先，采集圖象通常所用的系統(tǒng)是電荷耦合CCD(charge coupled device)照相機(jī);激光密度儀(laser densitometers)和Phospho或Fluoro imagers，對(duì)圖象進(jìn)行數(shù)字化。并成為以象素(pixels)為基礎(chǔ)的空間和網(wǎng)格。

  其次，在圖象灰度水平上過(guò)濾和變形，進(jìn)行圖象加工，以進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)。利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意義的區(qū)域與背景分離，精確限定斑點(diǎn)的強(qiáng)度、面積、周長(zhǎng)和方向。

  圖象分析檢測(cè)的斑點(diǎn)須與肉眼觀測(cè)的斑點(diǎn)一致。在這一原則下，多數(shù)系統(tǒng)以控制斑點(diǎn)的重心或**峰來(lái)分析，邊緣檢測(cè)的軟件可精確描述斑點(diǎn)外觀，并進(jìn)行邊緣檢測(cè)和鄰近分析，以增加精確度。通過(guò)閾值分析、邊緣檢測(cè)、銷蝕和擴(kuò)大斑點(diǎn)檢測(cè)的基本工具還可恢復(fù)共遷移的斑點(diǎn)邊界。以PC機(jī)為基礎(chǔ)的軟件Phoretix-2D正挑戰(zhàn)古老的Unix為基礎(chǔ)的2-D分析軟件包。

  第三，一旦2-DE圖象上的斑點(diǎn)被檢測(cè)，許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化。由于在2-DE中出現(xiàn)100%的重復(fù)性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質(zhì)的配比對(duì)于圖象分析系統(tǒng)是一個(gè)挑戰(zhàn)。IPG技術(shù)的出現(xiàn)已使斑點(diǎn)配比變得容易。因此，較大程度的相似性可通過(guò)斑點(diǎn)配比向量算法在長(zhǎng)度和平行度觀測(cè)。用來(lái)配比的**軟件系統(tǒng)包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計(jì)算機(jī)方法如相似性、聚類分析、等級(jí)分類和主要因素分析已被采用，而神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、子波變換和實(shí)用分析在未來(lái)可被采用。配比通常由一個(gè)人操作，其手工設(shè)定大約50個(gè)突出的斑點(diǎn)作為“路標(biāo)”，進(jìn)行交叉配比。之后，擴(kuò)展至整個(gè)膠。

  例如：精確的PI和MW(分子量)的估計(jì)通過(guò)參考圖上20個(gè)或更多的已知蛋白所組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算未知蛋白的PI和MW。 在凝膠圖象分析系統(tǒng)依據(jù)已知蛋白質(zhì)的pI值產(chǎn)生PI網(wǎng)絡(luò)，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配。所估計(jì)的精確度**依賴于所建網(wǎng)格的結(jié)構(gòu)及標(biāo)本的類型。已知的未被修飾的大蛋白應(yīng)該作為標(biāo)志，變性的修飾的蛋白的PI估計(jì)約在±0。25個(gè)單位。 同理，已知蛋白的理論分子量可以從數(shù)據(jù)庫(kù)中計(jì)算，利用產(chǎn)生的表觀分子量的網(wǎng)格來(lái)估計(jì)蛋白的分子量。 未被修飾的小蛋白的錯(cuò)誤率大約30%，而翻譯后蛋白的出入更大。 故需聯(lián)合其他的技術(shù)完成鑒定。

  微量測(cè)序

  蛋白質(zhì)的微量測(cè)序已成為蛋白質(zhì)分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息。盡管氨基酸組分分析和肽質(zhì)指紋譜(PMF)可鑒定由2-DE分離的蛋白，但*普通的N-末端Edman降解仍然是進(jìn)行鑒定的主要技術(shù)。已實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)微量測(cè)序的自動(dòng)化。 首先使經(jīng)凝膠分離的蛋白質(zhì)直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然后直接置于測(cè)序儀中，可用于subpicomole水平的蛋白質(zhì)的鑒定。 但有幾點(diǎn)需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個(gè)氨基酸的速率產(chǎn)生;與質(zhì)譜相比，Edman降解消耗大;試劑昂貴，每個(gè)氨基酸花費(fèi)3～4$。 這都說(shuō)明泛化的Edman降解蛋白質(zhì)不適合分析成百上千的蛋白質(zhì)。然而，如果在一個(gè)凝膠上*有幾個(gè)有意義的蛋白質(zhì)，或者如果其他技術(shù)無(wú)法測(cè)定而克隆其基因是必需的，則需要進(jìn)行泛化的Edman降解測(cè)序。

  近來(lái)，應(yīng)用自動(dòng)化的Edman降解可產(chǎn)生短的N-末端序列標(biāo)簽，這是將質(zhì)譜的序列標(biāo)簽概念用于Edman降解，業(yè)已成為一種強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)鑒定。當(dāng)對(duì)Edman的硬件進(jìn)行簡(jiǎn)單改進(jìn)，以迅速產(chǎn)生N-末端序列標(biāo)簽達(dá)10～20個(gè)/d，序列檢簽將適于在較小的蛋白質(zhì)組中進(jìn)行鑒定。若聯(lián)合其他的蛋白質(zhì)屬性，如氨基酸組分分析、肽質(zhì)質(zhì)量、表現(xiàn)蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)，可以更加可信地鑒定蛋白質(zhì)。選擇BLAST程序，可與數(shù)據(jù)庫(kù)相配比。采用一種Tagldent的檢索程序，還可以進(jìn)行種間比較鑒定，又提高了其在蛋白質(zhì)組研究中的作用。