EdU細胞増殖檢測試劑盒(紅色熒光)使用說明

產品簡介

使用前須知
       該產品是采用成像檢測方法對貼壁細胞進行檢測，適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器。非貼壁細胞可在孵育EdU后進行細胞涂片處理，固定后再采用貼壁細胞的染色流程進行檢測。也可以應用于流式細胞儀檢測。

實驗步驟(以24孔板，HK2貼壁細胞為例)

EdU標記
(a)      將細胞完全培養(yǎng)基中按照500: 1的 比例加入EdU溶液，制成2xEdU標記培養(yǎng)基；
(b)      提前將2xEdU標記培養(yǎng)基預熱，然后等體積加入到細胞原有培養(yǎng)基中，獲得lxEdU溶液，其中EdU的終濃度為10 uM；
注：    1)我們不建議替換全部培養(yǎng)基，因為這樣可能會影響細胞增殖的速度；
           2)配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒過細胞為宜；
(c)      每孔加入300ul含EdU培養(yǎng)基孵育細胞2小時，棄培養(yǎng)基；
注：   1)培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài)；
          2)大多數**細胞以及粘附細胞系均可采用2小時的孵育時間
(d)     以lxPBS清洗細胞兩次，毎次5分鐘，以除去未摻入DNA的EdU殘留。
注：  貼壁不牢的細胞可降低清洗強度。

細胞的固定和通透
(a)     每孔加入150ul 4%多聚甲醛細胞固定液，室溫培養(yǎng)30分鐘，棄固定液；
(b )    毎孔加入150ul 2mg/ml甘氨酸，搖床孵育5分鐘，以中和過量的多聚甲醛；
(c )    棄甘氨酸溶液，每孔加入300 ul PBS 洗液，室溫清洗5分鐘；

(d)     每孔加入300ul 0.5% Triton X-100細胞通透液，室溫通透10分鐘，棄細胞通透溶液；
(e )    每孔加入300ul PBS洗液，室溫清洗5分鐘；

EdU染色
(a)     通過用10: 1去離子水稀釋10x反應緩沖液進行配制1xEdU反應緩沖液；
(b)     按照溶解200mg緩沖添加劑溶于1ml去離子水的比例稱取適量的粉末進行溶解， 即為可用的緩沖添加劑的濃度，建議現(xiàn)用現(xiàn)配；
注：  緩沖添加劑為白色粉末，較難準確稱量，稱量范圍可稍微放寬，但是不應超過±20%，且該粉末較易氧化，使用后請旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需報廢或更換。
(c)     按照以下的表格進行染色反應液的配制：

(d)     每孔加入100ul配置好的檢測混合液，以覆蓋細胞為宜，避光、室溫孵育30分鐘。
(e)     棄染色反應液，加入300 ul  0.5% TritonX-100細胞滲透液清洗2-3次，每次10 分鐘；
(f)      棄細胞滲透液，用PBS洗兩次，每次5分鐘。

DNA染色

(a )    將Hoechst 33342用PBS 溶液1: 1000 進行稀釋得到終濃度為5ug/ml的 lx Hoechst染色液；
(b )    每孔加入300ul 1x Hoechst染色液，室溫避光孵育20-30分鐘后，棄染色液；
(c )    每孔加入300ul PBS洗細胞兩次，去掉洗液。

圖像獲取及分析
       建議染色完成后立即進行熒光顯微鏡拍照觀察；如果條件限制，請于4°C條件下避光濕潤保存3天之內完成拍照。若為細胞爬片或涂片， 可使用抗熒光淬滅封片劑進行封片后于4°C條件下保存及拍照檢測。

            案例圖示

  圖注：將HK2細胞分別用DMSO以及Cisplatin進行處理之后，通過我們公司的EdU檢測產品檢測藥品處理是否影響細胞的增殖能力。