流式細(xì)胞術(shù)廣泛用于分析細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子的表達(dá)、鑒定并確定異質(zhì)細(xì)胞群中的不同細(xì)胞類型、評(píng)估分離亞群的純度以及分析細(xì)胞大小和容積。
主要用于測(cè)定熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)蛋白產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，或結(jié)合了特定細(xì)胞分子的配體，如碘化丙啶與 DNA 的結(jié)合。
其染色過程包括從細(xì)胞培養(yǎng)物或組織樣品制備單細(xì)胞懸液。然后將獲得的細(xì)胞培養(yǎng)在包含未標(biāo)記或熒光標(biāo)記抗體的試管或多孔板中，再用流式細(xì)胞儀分析。
流式細(xì)胞儀主要有兩型：
臨床型（又稱：小型機(jī)、臺(tái)式機(jī)）和綜合型（又稱：大型機(jī)、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新產(chǎn)品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL，B-D公司最新產(chǎn)品為FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型；EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測(cè)分析功能外，還具有細(xì)胞分選功能，多用于科學(xué)研究。
流式細(xì)胞儀主要技術(shù)指標(biāo)
1.流式細(xì)胞儀的分析速度：
一般流式細(xì)胞儀每秒檢測(cè)1000～5000個(gè)細(xì)胞，大型機(jī)可達(dá)每秒上萬個(gè)細(xì)胞；
2.式細(xì)胞儀的熒光檢測(cè)靈敏度：
一般能測(cè)出單個(gè)細(xì)胞上<600個(gè)熒光分子，兩個(gè)細(xì)胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分；
3.前向角散射（FSC）光檢測(cè)靈敏度：
前向角散射（FSC）反映被測(cè)細(xì)胞的大小，一般流式細(xì)胞儀能夠測(cè)量到0.2μm～0.5μm；
4.流式細(xì)胞儀的分辨率：
通常用變異系數(shù)CV值來表示，一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到<2.0%，這也是測(cè)量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時(shí)要求必須達(dá)到的；
5.流式細(xì)胞儀的分選速度：
一般流式細(xì)胞儀分選速度＞1000個(gè)/秒，分選細(xì)胞純度可達(dá)99%以上；
流式細(xì)胞儀：射流
圖 1.流式細(xì)胞儀概覽。鞘液使細(xì)胞懸液聚攏，依次通過激光束，一次僅一個(gè)細(xì)胞。檢測(cè)器會(huì)檢測(cè)前向和側(cè)向散射光，以及染色細(xì)胞發(fā)射的熒光。
當(dāng)細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞儀時(shí)，從小噴嘴中流出的細(xì)胞懸液在鞘液的流體力學(xué)作用下向中心聚攏。形成的細(xì)流可使細(xì)胞依次通過激光束，一次僅一個(gè)細(xì)胞（圖 1）。
當(dāng)細(xì)胞通過激光束時(shí)，檢測(cè)器會(huì)檢測(cè)細(xì)胞或顆粒的散射光。前面的檢測(cè)器檢測(cè)前向散射光 (FS)，放置在側(cè)面的多個(gè)檢測(cè)器檢測(cè)側(cè)向散射光 (SS)，熒光檢測(cè)器則檢測(cè)被染色的細(xì)胞或顆粒發(fā)射的熒光。
流式細(xì)胞儀：前向和側(cè)向散射光的測(cè)定
細(xì)胞或顆粒通過光束并使光散射，這些散射光將以 FS 或 SS 的形式檢測(cè)。FS 與細(xì)胞的大小相關(guān)，SS 則與細(xì)胞顆粒度成比例。因此，通?？筛鶕?jù)細(xì)胞大小和顆粒度差異區(qū)分細(xì)胞群。
圖 2.綠色激光打到細(xì)胞上時(shí)的光散射。光的散射方向與細(xì)胞大小和顆粒度有關(guān)。
血液樣本流經(jīng)流式細(xì)胞儀的情況可有力地說明散射光與細(xì)胞的關(guān)系。
尺寸和顆粒度較大的粒細(xì)胞形成一個(gè)較大的細(xì)胞群，SS 和 FS 都很強(qiáng)，單核細(xì)胞尺寸較大，但其顆粒度較小，因此形成一個(gè)單獨(dú)的群，F(xiàn)S 較強(qiáng)但 SS 較弱，較小的淋巴細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞也行成一個(gè)單獨(dú)的群，F(xiàn)S 較弱。由于這兩種細(xì)胞都不是顆粒細(xì)胞，因此產(chǎn)生的 SS 也較弱。
因此，根據(jù)不同的 FS 和 SS 可將這些細(xì)胞分成不同的細(xì)胞群。
圖 3.FS 與 SS 散點(diǎn)圖。每一個(gè)散點(diǎn)到代表被流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的一個(gè)單細(xì)胞，不同細(xì)胞群的特征位置依據(jù)細(xì)胞大小和顆粒度確定。參考圖片出處：Riley 和 Idowu，Principles and Applications of Flow Cytometry（流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用）*。
流式細(xì)胞儀：散射光和熒光的測(cè)定
與根據(jù) FS 和 SS 區(qū)分細(xì)胞群類似，可根據(jù)是否表達(dá)特定蛋白區(qū)分細(xì)胞。這種情況下，通常使用熒光染料對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行染色。用于檢測(cè)目標(biāo)蛋白的熒光染料被相應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)的激光激發(fā)后會(huì)發(fā)射熒光。這些被熒光染色的細(xì)胞或顆粒會(huì)被單獨(dú)檢測(cè)。
受流式細(xì)胞儀中一組濾光片和鏡子的作用，前向和側(cè)向散射光以及染色細(xì)胞發(fā)射的熒光會(huì)被分成既定的波長(zhǎng)并分配通道。熒光會(huì)被過濾，以使各傳感器僅檢測(cè)特定波長(zhǎng)的熒光。這些傳感器稱為光電倍增管 (PMT)。
圖 4.熒光會(huì)被過濾，以使各 PMT 僅檢測(cè)特定波長(zhǎng)的光。PMT 會(huì)將光子能量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，即電壓。
如圖 4 所示，F(xiàn)ITC（異硫氰酸熒光素）通道中，PMT 僅檢測(cè) FITC 發(fā)射的波長(zhǎng)在 519 nm 附近的光。PE 通道中，PMT 僅檢測(cè) PE（藻紅蛋白）發(fā)射的波長(zhǎng)在 575 nm 附近的光。各 PMT 還會(huì)檢測(cè)其他的熒光染料，這些染料發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與其要檢測(cè)的熒光染料發(fā)射的熒光波長(zhǎng)相似。
流式細(xì)胞儀中裝有一組濾光片，以將相應(yīng)波長(zhǎng)的光子引導(dǎo)至特定的 PMT 上（圖 5）。
圖 5.流式細(xì)胞儀中的濾光片。帶通 (BP) 濾光片允許較小范圍波長(zhǎng)的光子通過，短通 (SP) 濾光片允許特定波長(zhǎng)以下的光子通過，
長(zhǎng)通 (LP) 濾光片則允許特定波長(zhǎng)以上的光子通過。雙色向?yàn)V光片/鏡子（如雙色向 LP 鏡子）面向光束 45° 角放置。
對(duì)于長(zhǎng)通雙色向?yàn)V光片，特定波長(zhǎng)以上的光子可直接通過，特定波長(zhǎng)以下的光子成 90° 角反射。
信號(hào)測(cè)定
當(dāng)帶熒光的細(xì)胞通過激光束時(shí)，會(huì)隨著時(shí)間產(chǎn)生發(fā)射光峰或脈沖。它們將被 PMT 檢測(cè)并轉(zhuǎn)換成電壓脈沖，這就是事件。流式細(xì)胞儀會(huì)檢測(cè)總脈沖高度和面積，并將測(cè)得的電壓脈沖直接與該事件的熒光強(qiáng)度相關(guān)聯(lián)。
圖 6.PMT 將檢測(cè)熒光細(xì)胞每次釋放的光子產(chǎn)生的電壓脈沖面積。當(dāng)沒有熒光標(biāo)記的細(xì)胞通過光學(xué)元件時(shí)，不會(huì)發(fā)射光子，也不會(huì)檢測(cè)到信號(hào)。當(dāng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞通過光學(xué)元件時(shí)，會(huì)受到激光照射并發(fā)射光子，因此檢測(cè)到的電壓強(qiáng)度會(huì)逐漸增強(qiáng)。隨著熒光細(xì)胞逐漸通過激光束，會(huì)隨著時(shí)間變化產(chǎn)生一段電壓脈沖。
通過積分各時(shí)刻脈沖的高度值得到脈沖面積，這由模數(shù)轉(zhuǎn)換器 (ADC) 的速度決定，也就是 10 MHz（即每秒 1000 萬次或每微秒 10 次）。
依據(jù)事件的脈沖強(qiáng)度（脈沖面積）為事件分配通道。增大通過 PMT 的電壓可以對(duì)信號(hào)進(jìn)行放大。
圖 7.利用通道號(hào)和事件數(shù)繪制的單參數(shù)直方圖。X 軸為用對(duì)數(shù)表示的通道。
根據(jù)測(cè)得的信號(hào)強(qiáng)度為每一事件分配通道號(hào)；熒光強(qiáng)度越高，事件的通道號(hào)就越大。
圖 8.陰性和陽性結(jié)果的熒光強(qiáng)度測(cè)定值。左側(cè)的陰性結(jié)果表明沒有染色的細(xì)胞且各事件的熒光強(qiáng)度都很低，右側(cè)的陽性結(jié)果表明存在大量熒光強(qiáng)度很高的事件。
在陽性結(jié)果中，可以看出陰性對(duì)照和陽性樣品間強(qiáng)度結(jié)果有所不同（圖 9）。
圖 9.人 PBMC 細(xì)胞對(duì)單核細(xì)胞設(shè)門的抗-CCR2 抗體 (ab21667) 染色結(jié)果。數(shù)據(jù)來自匿名 Abreview
抗體染色
直接染色：
在直接免疫熒光染色中，將細(xì)胞與直接偶聯(lián)到熒光染料（如 FITC）的抗體一同培養(yǎng)。該染色法僅需一步抗體培養(yǎng)，且消除了二抗的非特異性結(jié)合。
對(duì)于包含二抗的大型抗體 - 熒光染料復(fù)合物可能被捕獲而導(dǎo)致非特異性結(jié)合或無法進(jìn)入細(xì)胞防止一抗檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi)染色非常適用。
間接染色：
在間接染色中，一抗未用熒光標(biāo)記，而是通過熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。第二種試劑可以是能與一抗特異性結(jié)合的抗體。此外，還可使用親和素 - 生物素體系，這種方法將抗體偶聯(lián)到生物素上，再通過熒光染料標(biāo)記的親和素進(jìn)行檢測(cè)。
由于目前可用的偶聯(lián)抗體種類很多，這種方法可以將多種不同靶標(biāo)產(chǎn)生的未偶聯(lián)一抗用于與熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合，以進(jìn)行 FACS 分析。這大大提高了研究人員的可選靶標(biāo)蛋白范圍。
細(xì)胞內(nèi)染色：
用于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞內(nèi)抗原染色方案取決于可讓抗體接近內(nèi)部細(xì)胞蛋白的固定和透化方法。無論何種情況，成功的染色都離不開通過抗體滴定進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化、使用適合的對(duì)照正確設(shè)置流式細(xì)胞儀以及優(yōu)化的固定和透化步驟。
分泌蛋白的檢測(cè)：
分泌蛋白的檢測(cè)十分困難，因?yàn)榈鞍讜?huì)在檢測(cè)前從細(xì)胞中釋放出來且可能快速降解。高爾基體阻斷劑（如布雷非德菌素A）可用于抑制表達(dá)蛋白的分泌，使其仍保留在高爾基體中。然后再用細(xì)胞內(nèi)染色法檢測(cè)靶標(biāo)蛋白。
熒光染料偶聯(lián)劑的選擇
給定的抗體能否從陰性信號(hào)中分辨陽性信號(hào)取決于所用的熒光染料偶聯(lián)劑。
各熒光染料的相對(duì)強(qiáng)度一般指導(dǎo)原則是，從亮到暗依次為：PE、PE-Cy 7、PE-Cy5、APC、APC-Cy7、Alexa Fluor 647?、Alexa Fluor 700?、FITC、Pacific Blue 和 Alexa Fluor 488?。這是一般排序，個(gè)別抗體的相對(duì)強(qiáng)度可能有所差異。
高度表達(dá)的抗原通?？杀粰z測(cè)且與陰性對(duì)照區(qū)分開來，無論使用何種熒光染料。表達(dá)較少的抗原需要較亮的 PE 或 APC 偶聯(lián)劑提供的高信號(hào)背景比，以將陽性細(xì)胞完全從未染色的細(xì)胞中區(qū)分開來。
相對(duì)熒光染料強(qiáng)度取決于使用的儀器，因?yàn)椴煌瑑x器中的激光和濾光片組合會(huì)有所差異。因此，需要確保選用了合適的 FACS 儀器。
