我們知道WB實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣,一次實(shí)驗(yàn)歷時(shí)也不短,從提蛋白到顯影結(jié)束可能要三天,我們就講一下這里面的一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
一、蛋白提取及變性
1、提取蛋白 很多經(jīng)驗(yàn)豐富的WB實(shí)驗(yàn)者都深有體會(huì),蛋白提取是影響結(jié)果最重要的環(huán)節(jié)之一。該過程最重要的是防降解和保證蛋白濃度不要太低。防降解主要有兩點(diǎn),一是裂解前注意保持樣品處于低溫環(huán)境中,二是裂解時(shí)加入足夠的蛋白酶抑制劑。我們習(xí)慣先用冰冷的PBS做心臟的體循環(huán)灌注,然后冰上取腦,分離各腦區(qū)(嗅球,皮層,海馬,中腦,小腦,延髓,丘腦,紋狀體)后置于1.5EP管中,用液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80度冰箱長期保存。接著是保證蛋白濃度,即要加入適量的裂解液,加太少會(huì)使蛋白提取不充分,加太多會(huì)讓蛋白濃度太低,一般經(jīng)驗(yàn)是這樣的,細(xì)胞樣品例如一個(gè)六孔板的細(xì)胞加60微升的裂解液,動(dòng)物組織的話每毫克組織加10微升裂解液。最好還要加上超聲破碎處理,具體方案見?討論部分。如果沒有超聲破碎儀,那就用1毫升注射器不斷抽吸,冰上反復(fù)抽吸1分鐘左右,注意不要產(chǎn)生過多氣泡。(需要灌注取材的視頻可以私聊獲取,由于文件過大,又比較血腥,不宜直接放到文章里。)
2、蛋白變性 加入上樣緩沖液后100攝氏度煮10分鐘,這里的上樣緩沖液有兩種可選,一種是用beta巰基乙醇打開蛋白質(zhì)分子二硫鍵的,另一種是用DTT(二硫蘇糖醇)。兩者的作用是一樣的,但特點(diǎn)不一樣,前者更容易與氧氣反應(yīng),穩(wěn)定性比后者差,如果在常溫下暴露在空中,前者只能維持24小時(shí)的活性,后者卻可以維持7天左右。所以該如何選擇?如果是蛋白樣品較少,跑幾次就可以用完的樣品,這時(shí)選擇beta巰基乙醇。如果樣品很多,計(jì)劃跑上幾十次的,優(yōu)先選擇DTT,建議變性后分裝保存。
二、SDS-PAGE凝膠配制
1、配膠前準(zhǔn)備 首先強(qiáng)調(diào)一下,一塊好的膠是跑好蛋白的前提,所以這個(gè)環(huán)節(jié)也不容忽視。玻璃板的選擇,一種是1毫米厚度的,另一種是1.5毫米的,這個(gè)厚度選擇也是有講究的,如果上樣體積小于10微升,優(yōu)先選1毫米,否則選1.5毫米的。原因是什么?答案在轉(zhuǎn)膜部分揭曉。還有分離膠的濃度也要選擇適合的。然后玻璃板和梳子要洗干凈,晾干。裝板,注意厚板和薄板的底部要對(duì)齊,否則會(huì)漏膠。加制膠的各成分前,要觀察液體是否有沉淀,有沉淀的盡量不要用。
2、制膠 按配方說明依次加入各組分,加完SDS后先簡單手動(dòng)搖勻幾下,然后迅速加入過硫酸銨和TEMED,搖勻,緊接著就灌膠。然后我習(xí)慣用95%的酒精壓膠,我也用過純水,感覺純水壓沒那么好,由于水的密度較大,會(huì)把分界處的膠壓得膨大。靜置25分鐘后把酒精倒干,用吸水紙吸出多余的酒精,然后配壓縮膠,同樣的操作,關(guān)鍵是梳子要插得快,要小心梳子下產(chǎn)生氣泡,然后靜置30分鐘。如果是當(dāng)天跑膠,我會(huì)等上層膠凝2個(gè)小時(shí)再用,但要注意防干燥縮水,可以在一個(gè)小時(shí)的時(shí)候沿著梳子上緣加點(diǎn)電泳液。所以我一般提前一晚制膠,泡于純水或者電泳液里置于4度冰箱暫存。
三、蛋白電泳
1、上樣前準(zhǔn)備 把膠組裝到電泳芯上,注意密閉性(否則漏液),如果內(nèi)槽漏液就不是勻強(qiáng)電場了,最后條帶可能就不是一條直線。然后內(nèi)槽倒?jié)M電泳液,拔梳子,這一步要小心,梳子要兩邊一起緩緩?fù)习纬觯缓?/span>觀?察泳道內(nèi)有無脫落的膠?;蛘吣z絲,有的話用1毫升注射器吸出。然后從冰箱取出蛋白樣品,解凍。準(zhǔn)備振蕩器。
2、上樣和電泳 注意,上樣后蛋白會(huì)開始慢慢在膠中彌散,所以上樣越快越好。我習(xí)慣先上蛋白Marker,再上蛋白樣品,蛋白上樣前確保樣品完全解凍和充分振蕩(推薦使用振蕩器振蕩),吸的時(shí)候沒有拉絲即可,建議上樣前五分鐘把樣品從冰上取出來,不然樣品中SDS可能會(huì)結(jié)晶析出,從而影響電泳效果。上層膠80V 25分鐘,下層膠120V 65分鐘。
四、轉(zhuǎn)膜
1、轉(zhuǎn)膜前準(zhǔn)備 我會(huì)在電泳結(jié)束前30分鐘準(zhǔn)備,把轉(zhuǎn)膜液配好置于4度冰箱預(yù)冷,然后裁膜,準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜裝置,準(zhǔn)備碎冰和冰磚。最后把膜置于甲醇溶液中活化1分鐘,然后轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜液中平衡3分鐘后備用。
2、轉(zhuǎn)膜 組裝轉(zhuǎn)膜三明治夾,這一步很關(guān)鍵,最重要的是膠和膜之間不能有氣泡且膜與膠要保證貼合緊密(否則會(huì)翻車),可以加多點(diǎn)轉(zhuǎn)膜液泡著。組裝好后加滿轉(zhuǎn)膜液,設(shè)置電源參數(shù),我習(xí)慣恒流轉(zhuǎn)膜,200-280毫安,1-2小時(shí),根據(jù)分子量定,如50KD的分子用60分鐘就夠了。如果一個(gè)電源帶兩個(gè)轉(zhuǎn)膜大槽即四塊膠,我就會(huì)用恒壓70-110V。這個(gè)過程最重要的是做好降溫。這里簡單說一下蛋白分子量與玻璃板厚度,分離膠的濃度,轉(zhuǎn)膜電源參數(shù)的選擇問題。如果是能用1毫米的玻?璃板就不用1.5毫米的,因?yàn)檗D(zhuǎn)膜是在電場的作用下蛋白分子從膠上遷移到膜上,1毫米膠的蛋白遷移距離要比1.5毫米的短1/3。選擇更薄的膠蛋白轉(zhuǎn)膜時(shí)間可以減少,從而減少發(fā)熱,以免膠變形,條帶也會(huì)更好看。然后是分離膠的濃度,如果是150—200KD的分子選10% 以下的的分離膠,200—300KD的選8%的,300KD以上的選6%的,小于30KD的200mA 30分鐘,30-100KD的按分子量的數(shù)值算,如70KD,250mA 70分鐘;100-150KD的250mA 100分鐘;150—300KD的分子轉(zhuǎn)膜條件用280毫安(以上均是對(duì)于1.0mm的玻璃板來說的,1.5mm的要適當(dāng)延長時(shí)間),120分鐘足矣,前提是膠的濃度相適應(yīng)。
五、封閉孵一抗
1、封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,把膜先用TBST泡洗兩遍再用5%脫脂奶粉或者BSA室溫封閉1-2小時(shí)。注意一定要讓蛋白面充分接觸封閉液。
2、孵一抗 脫脂奶粉封閉?的話,要用TBST泡洗三遍再轉(zhuǎn)移至一抗溶液中,BSA封閉的可以直接轉(zhuǎn)移至一抗中。如果膜的寬(膜是一個(gè)長方形,這里的寬與長相對(duì)應(yīng))不大于8毫米,我習(xí)慣置于15毫升離心管中孵育,兩條膜"背對(duì)背"式放置于一個(gè)管子里(3毫升液體即可)。如果大于8毫米,就用普通的5格的一抗孵育盒(4毫升即可)。4度過夜,一般是12-18個(gè)小時(shí),注意放置水平,最好用搖床。內(nèi)參等蛋白豐度很高的如果孵久了可能出現(xiàn)條帶連在一起的情況,這時(shí)可以縮短孵育時(shí)間或者降低一抗的濃度。
六、孵二抗顯影
1、孵二抗 室溫一個(gè)小時(shí)足矣。這步要注意的是建議用5%BSA或者脫脂奶粉稀釋二抗,這樣背景會(huì)干凈許多。也要注意膜的蛋白面要充分接觸二抗溶液,我們一般一條膜一個(gè)槽地孵。
2、顯影 這一步有個(gè)細(xì)節(jié)可能有些同學(xué)沒注意到,就是ECL發(fā)光液要與HRP反應(yīng)一分鐘后顯影效果才會(huì)更好,還有要注意的是顯影液要均勻覆蓋,一般第二次顯影(加新的顯影液)比一次好看。
相關(guān)新聞
RELATED NEWS
掃一掃
關(guān)注微信
Copyright © 2020 上海東寰生物科技有限公司 版權(quán)所有