一、 何為內(nèi)參?
有一類基因被稱為管家基因,其表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小,而且是在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的大多數(shù),或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá),或變化很小。管家基因表達(dá)的蛋白質(zhì)就是我們WB實(shí)驗(yàn)中所說(shuō)的內(nèi)參。
二、為何需要內(nèi)參?
在Western blot實(shí)驗(yàn)中,我們通常需要檢測(cè)不同處理?xiàng)l件下的蛋白質(zhì)含量變化,但由于實(shí)驗(yàn)條件等因素的影響,不同樣品中蛋白質(zhì)總量可能會(huì)存在差異,因此需要使用內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用內(nèi)參可以消除實(shí)驗(yàn)條件等因素的影響,從而準(zhǔn)確地比較不同樣品中待檢測(cè)蛋白的含量變化。通俗地講,假設(shè)我們檢測(cè)到各組間目標(biāo)蛋白的信號(hào)強(qiáng)度明顯不同,可能是組間實(shí)際上就存在明顯表達(dá)差異(“真像”),也可能是由于我們加載的蛋白總量不同,或者蛋白轉(zhuǎn)移的效率不同等導(dǎo)致的“假象”。為了確保我們看到的條帶趨勢(shì)是“真像”,我們需要找到一種能夠反映蛋白質(zhì)總量的標(biāo)準(zhǔn),也就是內(nèi)參。我們將內(nèi)參作為參照物,用目標(biāo)蛋白信號(hào)強(qiáng)度除以內(nèi)參信號(hào)強(qiáng)度,得到的結(jié)果就能更準(zhǔn)確地反映出目標(biāo)蛋白在不同樣品中的表達(dá)水平。這就是為什么我們需要使用內(nèi)參的原因。
三、常用內(nèi)參有哪些?
1、總蛋白或者胞質(zhì)蛋白內(nèi)參(定位于細(xì)胞質(zhì))主要包括以下3類:
β-actin(肌動(dòng)蛋白):β-actin廣泛存在于不同類型的細(xì)胞中,分子量約為42 kDa,主要位于細(xì)胞質(zhì)中,是一種結(jié)構(gòu)蛋白,參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)等功能。
GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶):GAPDH參與細(xì)胞糖酵解途徑中的反應(yīng),分子量約為36 kDa,位于細(xì)胞質(zhì)中,廣泛存在于不同類型的細(xì)胞中。
tubulin(微管蛋白):tubulin是微管蛋白家族中的一員,主要參與細(xì)胞骨架的構(gòu)建,包括α和β兩種亞型,α-tubulin和β-tubulin分子量分別為55kD和50kD,其實(shí)際檢測(cè)條帶均在55kD左右,位于細(xì)胞質(zhì)中。
2、胞核蛋白內(nèi)參(定位于細(xì)胞核)主要包括以下2類:
Histone H3:是組蛋白家族的一員,主要存在于細(xì)胞核內(nèi),分子量約15 kD。
Lamin (包括A和B)是一種胞核內(nèi)骨架蛋白,與核膜結(jié)合,Lamin A的分子量約為74 kDa,Lamin B的分子量約為67 kDa。
3、胞膜蛋白內(nèi)參(定位于細(xì)胞膜):
鈉鉀ATP酶(Na/K ATPase):在哺乳動(dòng)物中,Na/K ATPase的α亞單位分子量為約110 kDa,β亞單位分子量為約33 kDa。
4、細(xì)胞器內(nèi)參
四、內(nèi)參蛋白的選擇策略
1、內(nèi)參選擇的總體策略:
首先,最重要的一條原則是,內(nèi)參在樣品中含量相對(duì)穩(wěn)定,不受實(shí)驗(yàn)處理的影響,這樣才能保證不同樣本之間的比較是可靠的。
其次,選擇與待檢測(cè)蛋白在生物學(xué)功能上無(wú)關(guān)的蛋白作為內(nèi)參。
最后,內(nèi)參的分子量與目標(biāo)蛋白質(zhì)不同,易于區(qū)分。一般建議分子量相差5KD以上。
2、內(nèi)參選擇的步驟:
先通過(guò)權(quán)威的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot(https://www.uniprot.org/) 查找目的蛋白的信息,包括細(xì)胞亞定位(用以選擇提取總蛋白、膜蛋白、胞質(zhì)蛋白、核蛋白還是細(xì)胞器蛋白),分子量(區(qū)分內(nèi)參蛋白的分子量)。
然后根據(jù)查到的信息,確定要提取的蛋白類型(總、膜、胞質(zhì)、核還是細(xì)胞器),按以下建議選擇內(nèi)參:
1) 如果我們提取的是總蛋白或者胞質(zhì)蛋白,從β-actin、GAPDH和tubulin中選擇其中1種就夠了。
2) 如果我們提取的是核蛋白(使用核蛋白抽提試劑盒),那么選擇Histone H3或Lamin兩種之一即可。
3) 如果我們提取的是膜蛋白(使用膜蛋白抽提試劑盒),那么選擇Na/K ATPase。
4) 如果是分離線粒體后提取的蛋白,可以選擇COX IV。
需要注意的是,某些病理生理狀態(tài)下,有些管家基因的表達(dá)會(huì)受到明顯干擾。比如:
GAPDH不宜作為糖代謝紊亂和缺氧的狀態(tài)下的樣本的內(nèi)參。
Lamin不宜用來(lái)做凋亡實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參。
Tubulin不宜作為經(jīng)抗癌和抗真菌藥處理過(guò)的樣本的內(nèi)參。
Lamin B不宜作為胚胎干細(xì)胞的內(nèi)參。
PCNA不宜作為非增殖細(xì)胞的內(nèi)參等。
對(duì)于分泌性樣本,如血漿、乳汁等,由于沒(méi)有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),應(yīng)選擇分泌蛋白作為內(nèi)參比如Transferrin。
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