一、實驗準備
1、健康的HEK 293T細胞,一般使用復蘇后10代以內(nèi)的細胞進行慢病毒的生產(chǎn),要求無細菌、真菌以及支原體污染;
2、轉(zhuǎn)染試劑,如PEI、Higene、lipo2000或lipo3000
各種轉(zhuǎn)染試劑的步驟稍有差別,小助手以PEI為轉(zhuǎn)染試劑。
3、DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基、DMEM完全培養(yǎng)基(10%FBS和1%P/S);
4、10mL無菌注射器(環(huán)氧乙烷滅菌處理);
5、0.45μm的細菌濾器。
二、包裝步驟
Day1
(7:00 PM)鋪板HEK 293T細胞
數(shù)量:400萬/10 cm dish ;覺得計數(shù)麻煩的話,可以在293T細胞長到約90%匯合時,1:5傳代(均分成5份),每1份的數(shù)目差不多就是400萬了。
Day2
(3:00 PM)三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
在培養(yǎng)箱中恢復細胞狀態(tài)約20h,此時可進行轉(zhuǎn)染。三質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染體系三種質(zhì)粒的配比有許多種方式,目前MDL使用4:3:1的比例,即PxpAx2:PMD2g:PLVX(載有你基因的質(zhì)粒)。10cm dish一般轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的總質(zhì)量為20μg,PEI的量為質(zhì)粒的2.5-3倍(也就是50μg-60μg,一般推薦按照2.5倍來)。按照比例算下來,PxpAx2:PMD2g:PLVX的質(zhì)量比為:(10ug:7.5ug:2.5ug)
注意:在提到質(zhì)粒的量時,千萬記得說質(zhì)量而不是濃度,不然容易出錯。
實驗步驟:
取如上總質(zhì)量為20μg的質(zhì)粒添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中,記為A液,移液槍混勻20次;
取PEI(一般配置成1μg/mL)50-60μg(也就是50-60μL)添加到總體積500μL的DMEM無血清無雙抗培養(yǎng)基中,記為B液,移液槍混勻20次;
將B液逐滴滴加到A液中,移液槍輕柔混勻66次,室溫靜置15-20min;
將靜置好的轉(zhuǎn)染試劑(A+B)緩緩滴加到恢復狀態(tài)20h的HEK 293T細胞中。
做好標記,記好轉(zhuǎn)染時間、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、換液時間等參數(shù)提高實驗重復性。
Day3
(9:00 AM)換液
轉(zhuǎn)染后的第18h,將含有轉(zhuǎn)染試劑的HEK 293T上清更換為10mL DMEM完全培養(yǎng)基;對于新手,為了防止你在換液時將細胞吹散,可以留3mL的液體在dish中,更換8mL DMEM完全培養(yǎng)基。
Day4
(3:00 PM)收集病毒液
在轉(zhuǎn)染后的48-72h,為病毒生產(chǎn)的高峰期,一般我們收集轉(zhuǎn)染后48h(換液后30h,產(chǎn)毒30h)的病毒液用于實驗,足以滿足大部分實驗需求。收集病毒于15mL tube中,500g,5mL離心去細胞碎片和雜質(zhì),隨后使用注射器和濾器進行過濾。收集后的病毒上清可以用來進行感染和儲存。
三、慢病毒滴度測定
病毒滴度的單位為:TU/mL,代表每毫升病毒液中具有轉(zhuǎn)導功能的病毒顆粒的數(shù)目。
計算公式為:滴度=(感染時細胞數(shù)(個)*陽性細胞%)/病毒液體積(mL)
病毒液體積和感染時細胞數(shù)已知,需通過流式細胞術(shù)確認陽性細胞百分比。
滴度測定常常使用HEK 293T細胞,大致的原理為,將在DAY3收集到的病毒上清,按照梯度添加到293T細胞中,感染后48h檢測陽性細胞的比例,從而確定病毒的滴度。
四、注意事項
293T細胞的代數(shù)最好用15代以內(nèi),最多不超過20代,否則影響轉(zhuǎn)染效率。質(zhì)粒濃度在400-1000ng/μL范圍,純度260/280在1.8-2.0之間的轉(zhuǎn)染效率較高?;旌象w輕輕滴入細胞上清后搖勻,動作要輕,293T細胞貼壁不牢避免細胞脫落。
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