一、RNA模板制備

RNA是反轉(zhuǎn)錄的模板?？俁NA通常用于RT-(q)PCR等下游應(yīng)用的cDNA合成，而特定類型的RNA（如信使RNA（mRNA）、miRNA等小RNA）可通過富集而用于某些實驗應(yīng)用，如cDNA文庫構(gòu)建和miRNA圖譜分析。

保持RNA的完整性至關(guān)重要，在提取、處理、儲存和實驗過程中均需要采取特殊的保護(hù)措施。防止RNA降解的最佳方法包括佩戴手套、使用具有氣溶膠屏障的移液器移液、使用無核酸酶的實驗室器具和試劑以及對實驗區(qū)域進(jìn)行去污處理。

根據(jù)來源材料（如血液、組織、細(xì)胞、植物）的類型和實驗?zāi)繕?biāo)，有多種RNA分離和純化方法可供選擇。分離純化過程的主要目標(biāo)是穩(wěn)定RNA分子、抑制RNA酶，并通過適當(dāng)?shù)膬Υ婧吞崛》椒ㄗ畲蟪潭忍岣弋a(chǎn)量。最佳的純化方法可以去除干擾酶活性的內(nèi)源性化合物，如植物組織中的復(fù)合多糖和腐殖酸，以及反轉(zhuǎn)錄酶的常見抑制劑，如鹽、金屬離子、乙醇和苯酚。純化的RNA應(yīng)保存在-80°C，盡量減少反復(fù)凍融。

純化后評估RNA質(zhì)量和數(shù)量的方法有許多種。常用的方法是利用紫外光譜法檢測特定波長的吸光度。RNA質(zhì)量可通過利用Beer-Lambert定律測定260 nm處的吸光度而確定；不同波長的吸光度比值可以確定是否存在特定污染物（表1）。請注意，紫外吸光度不是RNA特有的，所有核酸都可以吸收相近波長的紫外線。對于需要更高RNA特異和更靈敏分析的RNA, 可以考慮使用含染料的熒光試劑，這種試劑只在特異性的與目標(biāo)分子結(jié)合時才會釋放熒光信號。

以28S和18S核糖體RNA（rRNA）的比值可評估RNA的完整性。將總RNA變性后進(jìn)行凝膠電泳，可對其進(jìn)行定性評估。然后，評估28S rRNA與18S rRNA的強度比，比值為2:1代表完整的RNA（圖1A）。Agilent Technologies開發(fā)的一種方法結(jié)合了微流體學(xué)和專利算法，可定量評估RNA的完整性。該方法可產(chǎn)生數(shù)字讀數(shù)，稱為RNA完整性分?jǐn)?shù)或RIN值，數(shù)值介于8至10之間代表高質(zhì)量的RNA [1,2]（圖1B）。

二、基因組DNA的去除

某些情況下，痕量基因組DNA（gDNA）可能與RNA共同被純化。污染gDNA可能會干擾反轉(zhuǎn)錄結(jié)果，導(dǎo)致RT-qPCR等高靈敏度實驗出現(xiàn)假陽性、高背景或檢測率降低。

為去除gDNA，通常在RNA分離過程中加入DNase I。在進(jìn)行RT-(q)PCR之前，必須完全去除DNase I，因為任何殘留的酶都會使單鏈DNA（如引物和cDNA）降解。通常，DNase I失活（如，EDTA和加熱處理）或酶去除步驟會導(dǎo)致RNA降解或樣品損失。

作為DNase I的替代品，可使用雙鏈特異性DNase去除污染gDNA，而不影響RNA或單鏈DNA。它們的熱分解性質(zhì)使其在相對溫和的溫度（如55℃）下即可失活，同時沒有負(fù)面影響。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前，只需將這種雙鏈特異性DNase與RNA在37℃下孵育2分鐘，從而簡化實驗流程（圖2）。

三、反轉(zhuǎn)錄酶選擇

反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA，但這一類反轉(zhuǎn)錄酶可能具有不同的功能活性和性質(zhì)。它們的性質(zhì)會影響其反轉(zhuǎn)錄長鏈RNA、高GC含量RNA、具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA和不純RNA的能力。

分子生物學(xué)中使用的大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶來源于禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的pol基因。AMV反轉(zhuǎn)錄酶是實驗室中首批用于cDNA合成的酶之一。該酶是一種分子量為170-kDa的異二聚體，最佳反應(yīng)溫度范圍為42-48℃。AMV反轉(zhuǎn)錄酶具有較強的RNase H活性，可降解RNA:cDNA復(fù)合物中的RNA，獲得的cDNA片段較短（<5 kb）。

MMLV反轉(zhuǎn)錄酶因具有單體結(jié)構(gòu)而成為常用的替代品，可對重組酶進(jìn)行更簡單的克隆和修飾。MMLV反轉(zhuǎn)錄酶是一種分子量為75 kDa的酶，反應(yīng)溫度約為37°C。雖然MMLV的熱穩(wěn)定性低于AMV反轉(zhuǎn)錄酶，但其RNase H活性較低，因此具有更高的長cDNA（<7kb）合成效率[3]。

為了進(jìn)一步改善cDNA合成，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)過改造具有更低的RNase H活性（即RNase H Minus，將RNase H結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變）、更高的熱穩(wěn)定性（高達(dá)55℃）和更強的持續(xù)合成能力（65倍以上）。這些屬性改變可增加cDNA長度和產(chǎn)量，提高靈敏性，改善抑制劑耐受性，并縮短反應(yīng)時間（表2）[4]。

四、引物選擇

為了啟動反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄酶需要一種短DNA寡核苷酸（即引物）與其互補序列在RNA模板上結(jié)合，并作為新鏈合成的起點。根據(jù)RNA模板和下游應(yīng)用，有三種基本類型的引物可供選用：oligo（dT）引物、隨機引物和基因特異性引物（圖3）。

? Oligo（dT）引物由12-18個脫氧胸腺核苷酸組成，可與真核mRNA的poly(A) 尾退火。其為從真核生物mRNA構(gòu)建cDNA文庫、全長cDNA克隆和cDNA 3'末端快速擴增（3'RACE）的最佳選擇。由于oligo(dT)引物對poly(A) 尾的特異性，其不適用于降解的RNA，如來自FFPE樣品的RNA，也不適用于缺少poly(A) 尾的RNA，如原核生物RNA和microRNA。由于cDNA合成開始于3' poly（A）尾，oligo(dT)引物可能引起3'末端偏差。具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA也可能影響全長cDNA合成，導(dǎo)致5'末端的代表性偏低。

通過修飾Oligo(dT)引物，可以提高反轉(zhuǎn)錄效率。例如，Oligo(dT)引物的長度可以延伸到20個核苷酸或更長，使其在較高溫度下退火。在一些情況下，Oligo(dT)引物可能包括3'末端的多義堿基，如dN（dA，dT，dG或dC）和dV（dG，dA或dC）。該修飾可防止poly(A)滑移，并且將起始位點鎖定在poly(A)尾的上游位置。這些引物被稱為錨定oligo(dT)。

? 隨機引物是具有隨機堿基序列的寡核苷酸，通常由6個核苷酸組成，被稱為隨機六聚體、N6或dN6。由于隨機引物的隨機結(jié)合（即沒有模板特異性），其可以退火到樣本中的任何類型RNA。因此，這些引物被認(rèn)為可以用于無poly（A）尾結(jié)構(gòu)（如rRNA、tRNA、非編碼RNA、小RNA、原核mRNA）的RNA、降解RNA（如來自FFPE組織的RNA）和具有已知二級結(jié)構(gòu)的RNA（如病毒基因組）的反轉(zhuǎn)錄。

雖然隨機引物有助于改善cDNA合成，但它們不適合用于長RNA的全長反轉(zhuǎn)錄。增加隨機六聚體引物的濃度可提高cDNA產(chǎn)量，但同時也會增加相同模板上與多個位點的結(jié)合，從而導(dǎo)致cDNA片段較短（圖4）。

此外，隨機引物可能不適用于某些RT-PCR應(yīng)用。例如，高估m(xù)RNA拷貝數(shù)就是一個需要考慮的問題[5]。兩步法RT-PCR經(jīng)常使用oligo(dT)和隨機引物的混合物，結(jié)合每種類型引物的優(yōu)點。在microRNA（miRNA）表達(dá)檢測中，隨機六聚體并不適用，必須為miRNA的反轉(zhuǎn)錄設(shè)計特殊引物[6,7]。

圖4. cDNA的長度和產(chǎn)量受到所選擇引物和引物濃度的影響。使用oligo (dT)引物和不同濃度的隨機六聚體引物，將具有poly(A)尾的6.4 kb RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA。通過瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果可以看到，使用oligo（dT）引物可獲得更分散、更長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，相比之下，增加隨機六聚體的濃度，可產(chǎn)生更高濃度的短cDNA。

? 基因特異性引物可提供特異性最強的反轉(zhuǎn)錄引物配對。這些引物是根據(jù)目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計的。由于引物與特異性RNA序列結(jié)合，每個目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)對多種目標(biāo)進(jìn)行分析時，則需要使用更多的RNA樣本。基因特異性引物通常用于一步RT-PCR實驗應(yīng)用。

五、主要反應(yīng)組分

除了反轉(zhuǎn)錄酶和引物之外，其它主要反應(yīng)組分還包括RNA模板（預(yù)處理以去除基因組DNA）、緩沖液、dNTP、DTT、RNA酶抑制劑和RNase-free水（圖5）。

? RNA模板按本文前述方法制備。表4提供了反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的推薦RNA起始量范圍，最佳起始量取決于目標(biāo)序列的普遍性和反轉(zhuǎn)錄酶的靈敏性。

? 反應(yīng)緩沖液可維持反應(yīng)的最佳pH和離子強度。提供的緩沖液還可能含有提高反轉(zhuǎn)錄效率的添加劑。

? dNTPs通常為0.5-1 mM，最好為等摩爾濃度。推薦使用新鮮稀釋的高品質(zhì)dNTP，以確保良好的反轉(zhuǎn)錄效果。

? DTT，一種還原劑，通常用于提供最佳的酶活性。如果DTT或其他添加劑發(fā)生沉淀，會降低反應(yīng)效率；因此，應(yīng)溶解反應(yīng)組分并充分混勻。

? RNA酶抑制劑通常包含在反應(yīng)緩沖液中或單獨被添加到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，用于防止RNA降解。RNase可能在RNA分離過程中被共同純化，或者在反應(yīng)體系配制期間被引入。已知的RNase有許多種，應(yīng)根據(jù)其作用方式和反應(yīng)要求選擇合適的RNA酶抑制劑。

? 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用的水應(yīng)不含有核酸酶。最好選用商業(yè)化供應(yīng)的無核酸酶水，或經(jīng)DEPC（焦碳酸二乙酯）處理去除RNase的水。污染RNase不能通過簡單的過濾去除，而且由于RNase是熱穩(wěn)定的，無法通過高壓消毒去除。

六、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包含三個主要步驟：引物退火、DNA聚合和酶失活（圖6）。這些步驟的溫度和持續(xù)時間因選擇的引物、目標(biāo)RNA和使用的反轉(zhuǎn)錄酶而異。

? 引物退火：將引物與RNA模板混合，加熱至65℃并維持5分鐘，然后冰浴至少1分鐘。這有助于確保RNA保持單鏈以及引物與靶標(biāo)有效退火。退火后，加入反轉(zhuǎn)錄酶和必需組分（如緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑）。

? DNA聚合：在此步驟中，反應(yīng)溫度和持續(xù)時間可能會根據(jù)所使用的引物和反轉(zhuǎn)錄酶而變化。使用oligo (dT)引物（Tm?35-50 ℃），可以在反轉(zhuǎn)錄酶的最佳反應(yīng)溫度（37-50 ℃）下直接孵育反應(yīng)。隨機六聚體引物因其較短的長度，通常具有較低的Tm（?10-15℃）。因此，當(dāng)使用隨機六聚體引物（單獨使用或與oligo（dT）結(jié)合使用）時，我們建議在加入酶后，在室溫（?25℃）孵育10分鐘以延伸引物。

反轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性各不相同，而熱穩(wěn)定性決定了每種酶的最佳聚合溫度。使用熱穩(wěn)定的反轉(zhuǎn)錄酶，可達(dá)到更高的反應(yīng)溫度（如50 ℃），有助于高GC或具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)RNA的變性，同時不影響酶活性（圖7）。

聚合時間取決于反轉(zhuǎn)錄酶的持續(xù)合成能力，即單次合成過程中摻入的核苷酸數(shù)量。例如，持續(xù)合成能力較低的野生型MMLV反轉(zhuǎn)錄酶通常需要60多分鐘才能完成cDNA合成。相比之下，持續(xù)合成能力較高的改良型反轉(zhuǎn)錄酶可能只需要10分鐘時間，就可以合成9 kb cDNA。

圖7. 熱穩(wěn)定性對反轉(zhuǎn)錄酶活性的影響。使用oligo（dT）引物和放射性標(biāo)記dNTPs，對含有不同長度RNA的樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。通過凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物，并通過放射自顯影進(jìn)行顯色。熱穩(wěn)定的反轉(zhuǎn)錄酶即使在50℃以上也能得到高cDNA產(chǎn)量。

? 酶失活：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的最后一步是將反轉(zhuǎn)錄酶失活處理。失活溫度范圍為70-85 ℃，具體取決于酶的熱穩(wěn)定性。失活通常需要5-15分鐘，溫度越高，所需時間越短。

七、第一鏈和第二鏈cDNA合成

如前所述，從RNA模板合成cDNA，產(chǎn)生cDNA:RNA復(fù)合物。該過程被稱為第一鏈cDNA合成。如果存在RNase H活性（如野生型AMV和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶），則cDNA:RNA復(fù)合物中的RNA會在第一鏈合成期間被切割。第一鏈cDNA可以直接用于RT-PCR等實驗應(yīng)用中，熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）將復(fù)制cDNA的互補鏈。

在cDNA文庫構(gòu)建和測序中，將第一鏈cDNA作為模板，獲得代表RNA靶標(biāo)的雙鏈cDNA。這個過程被稱為第二鏈cDNA合成。在第二鏈cDNA合成中，推薦使用RNase H活性最小的反轉(zhuǎn)錄酶，從而最大限度地增加cDNA合成長度和產(chǎn)量。

雙鏈cDNA的合成可以使用多種DNA聚合酶（如T7 DNA聚合酶、DNA聚合酶I、Taq DNA聚合酶）生成cDNA第一鏈的互補鏈。以下列舉的一些其它酶也可按照Gubler-Hoffman改良方法[8]（圖8）用于雙鏈cDNA合成。

? E. coli RNase H切割cDNA:RNA復(fù)合物中的RNA鏈，為DNA合成提供3'-OH引物結(jié)合位點

? E. coli DNA polymerase I利用5′-3′'聚合酶活性延伸切口RNA鏈，并利用5'-3'外切核酸酶活性沿合成方向替換RNA鏈，該過程被稱為切口平移。

? E. coli DNA ligase縫合新合成cDNA片段之間的切口。（T4 DNA連接酶不能用作替代物，因為它會連接鈍端雙鏈cDNA片段并形成嵌合結(jié)構(gòu)。）