EdU細(xì)胞增殖檢測

細(xì)胞增殖是評價細(xì)胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指標(biāo)。EdU (5-Ethynyl-2,- deoxyuridine)是一種胸腺喃陡核苷類似物，其連有的炔烴基團(tuán)在天然化合物中很少見，能夠在細(xì)胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復(fù)制的DNA分子中，通過基于EdU與熒光染料的特異性共軛反應(yīng)，把熒光集團(tuán)標(biāo)記到新合成的含有EdU的DNA上面，這樣就可以進(jìn)行高效快速的檢測出DNA復(fù)制活性，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長與發(fā)育、DNA損傷修復(fù) 等方面的研究。

EdU細(xì)胞増殖檢測試劑盒(紅色熒光)使用說明

產(chǎn)品簡介

細(xì)胞增殖是評價細(xì)胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指標(biāo)。EdU (5-Ethynyl-2,- deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其連有的炔烴基團(tuán)在天然化合物中很少見，能夠在細(xì)胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復(fù)制的DNA分子中，通過基于EdU與熒光染料的特異性共軛反應(yīng)，把熒光集團(tuán)標(biāo)記到新合成的含有EdU的DNA上面，這樣就可以進(jìn)行高效快速的檢測出DNA復(fù)制活性，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長與發(fā)育、DNA損傷修復(fù)等方面的研究。

傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法需要DNA變性、抗原修復(fù)、抗原抗體過夜孵育等復(fù)雜繁瑣的操作步驟。而EdU檢測方法不需要劇烈的DNA變性，只需溫和的細(xì)胞固定化和透化處理，能夠較好地保護(hù)細(xì)胞形態(tài)、DNA整體結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)抗原識別位點(diǎn)，操作步驟更加快速、靈敏和準(zhǔn)確。EdU與胸腺嘧啶(T )結(jié)構(gòu)非常相似，而EdU染料大小只有BrdU抗體的1/500,在細(xì)胞內(nèi)很容易擴(kuò)散，無需DNA變性(酸解、熱解、酶解等)，可有效避免樣品損傷，而且無需抗原抗體反應(yīng)，能在細(xì)胞和組織水平更快速便捷地反映DNA復(fù)制活性。

試劑盒組分

產(chǎn)品編號	試劑	濃度	試劑量	保存條件
C1501/1502/1503	EdU溶液	1000X	40ul	室溫運(yùn)輸，4℃長期儲存，勿凍存，熒光試劑請避光保存。
	反應(yīng)緩沖液	10X	1 ml
	催化劑溶液	25x	400ul
	TAMRA 紅色熒光溶液	400x	25ul
	緩沖添加劑	粉末	200 mg
	Hoechst 33342	1000X	20ul

使用前須知
該產(chǎn)品是采用成像檢測方法對貼壁細(xì)胞進(jìn)行檢測，適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器。非貼壁細(xì)胞可在孵育EdU后進(jìn)行細(xì)胞涂片處理，固定后再采用貼壁細(xì)胞的染色流程進(jìn)行檢測。也可以應(yīng)用于流式細(xì)胞儀檢測。

實(shí)驗(yàn)步驟(以24孔板，HK2貼壁細(xì)胞為例)

EdU標(biāo)記
(a)   將細(xì)胞完全培養(yǎng)基中按照500: 1的比例加入EdU溶液，制成2xEdU標(biāo)記培養(yǎng)基；
(b)      提前將2xEdU標(biāo)記培養(yǎng)基預(yù)熱，然后等體積加入到細(xì)胞原有培養(yǎng)基中，獲得lxEdU溶液，其中EdU的終濃度為10 uM；
注： 1)我們不建議替換全部培養(yǎng)基，因?yàn)檫@樣可能會影響細(xì)胞增殖的速度；
2)配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒過細(xì)胞為宜；
(c)      每孔加入300ul含EdU培養(yǎng)基孵育細(xì)胞2小時，棄培養(yǎng)基；
注： 1)培養(yǎng)時間取決于細(xì)胞的增殖速度和生長狀態(tài)；
2)大多數(shù)**細(xì)胞以及粘附細(xì)胞系均可采用2小時的孵育時間
(d)     以lxPBS清洗細(xì)胞兩次，毎次5分鐘，以除去未摻入DNA的EdU殘留。
注：  貼壁不牢的細(xì)胞可降低清洗強(qiáng)度。

細(xì)胞的固定和通透
(a) 每孔加入150ul 4%多聚甲醛細(xì)胞固定液，室溫培養(yǎng)30分鐘，棄固定液；
(b ) 毎孔加入150ul 2mg/ml甘氨酸，搖床孵育5分鐘，以中和過量的多聚甲醛；
(c ) 棄甘氨酸溶液，每孔加入300 ul PBS 洗液，室溫清洗5分鐘；

(d) 每孔加入300ul 0.5% Triton X-100細(xì)胞通透液，室溫通透10分鐘，棄細(xì)胞通透溶液；
(e ) 每孔加入300ul PBS洗液，室溫清洗5分鐘；

EdU染色
(a)     通過用10: 1去離子水稀釋10x反應(yīng)緩沖液進(jìn)行配制1xEdU反應(yīng)緩沖液；
(b)     按照溶解200mg緩沖添加劑溶于1ml去離子水的比例稱取適量的粉末進(jìn)行溶解，即為可用的緩沖添加劑的濃度，建議現(xiàn)用現(xiàn)配；
注：  緩沖添加劑為白色粉末，較難準(zhǔn)確稱量，稱量范圍可稍微放寬，但是不應(yīng)超過±20%，且該粉末較易氧化，使用后請旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需報(bào)廢或更換。
(c) 按照以下的表格進(jìn)行染色反應(yīng)液的配制：

染色反應(yīng)液組分	500ul	1 ml	2 ml	5 ml
IX反應(yīng)緩沖液	430ul	860ul	1.8 ml	4.3 ml
催化劑溶液	20 ul	40 ul	80 ul	200 ul
TAMRA紅色熒光溶液	1.2 ul	2.5 ul	5 ul	12.5 ul
緩沖添加劑	50 ul	100 ul	200 ul	500 ul

(d) 每孔加入100ul配置好的檢測混合液，以覆蓋細(xì)胞為宜，避光、室溫孵育30分鐘。
(e) 棄染色反應(yīng)液，加入300 ul 0.5% TritonX-100細(xì)胞滲透液清洗2-3次，每次10 分鐘；
(f) 棄細(xì)胞滲透液，用PBS洗兩次，每次5分鐘。

DNA染色

(a ) 將Hoechst 33342用PBS 溶液1: 1000 進(jìn)行稀釋得到終濃度為5ug/ml的 lx Hoechst染色液；
(b ) 每孔加入300ul 1x Hoechst染色液，室溫避光孵育20-30分鐘后，棄染色液；
(c ) 每孔加入300ul PBS洗細(xì)胞兩次，去掉洗液。