EU新生RNA檢測試劑
產(chǎn)品簡介
細胞內新生RNA的變化是評價細胞活性的重要指標。EU (5-Ethynyl-Uridine) 是一種尿嘧啶核苷類似物, 能夠在細胞RNA轉錄時期代替尿嘧啶(U) 摻入新合成的RNA分子中, 然后通過基于EU 與熒光染料的特異性共軛反應,把熒光集團標記到新合成的含有EU 的RNA分子中,這樣就可以進行較快的的熒光檢測RNA的轉錄活性。本試劑盒將直接測定細胞內新生RNA的變化。
傳統(tǒng)的檢測新生RNA的方法為以放射性同位素標記RNA等方法然后進行Southern blot進行檢測。但是這種方法需要放射性同位素標記及后續(xù)的復雜操作步驟。利用EU標記新生RNA的檢測方法不需要劇烈的RNA變性,只需溫和的細胞固定化和透化處理,能夠較好地保護細胞形態(tài)、RNA整體結構及細胞內抗原識別位點,操作步驟更加便捷、靈敏和準確,能在細胞水**映新生RNA轉錄活性的狀況。該試劑只需要簡單的操作步驟,適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡以及高內涵篩選儀進行新生RNA的轉錄活性。
試劑組分
產(chǎn)品編號 |
試劑 |
濃度 |
試劑量 |
C01901 |
EU 溶液 |
1000× |
40 μl |
細胞固定液 |
1× |
15 ml |
|
反應緩沖液 |
10× |
1 ml |
|
催化劑溶液 |
25× |
400 μl |
|
TAMRA紅色熒光溶液 |
400× |
25 μl |
|
緩沖添加劑 |
粉末 |
200 mg |
|
Hoechst 33342 |
1000× |
20 μl |
運輸及保存方式
藍冰運輸。-20℃避光長期保存,避免反復凍融。如短時間內需多次重復使用,請于4℃避光保存,有效期半年。
使用前須知
該試劑是采用成像檢測方法對貼壁細胞進行檢測,適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器。非貼壁細胞可在孵育EU后進行細胞涂片處理,固定后再采用貼壁細胞的染色流程進行檢測。
實驗準備
1、蓋玻片
2、1×PBS(pH7.2-7.6)(用DEPC水配置)
3、含0.5% Triton X-100的PBS(用DEPC水配置)
4、甘氨酸溶液(2mg/ml) (用DEPC水配置)
5、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
實驗參考
|
96孔板 |
48孔板 |
24孔板 |
12孔板 |
6孔板 |
EU培養(yǎng)基 |
100 μl |
200 μl |
300 μl |
500 μl |
1 ml |
染色反應液 |
100 μl |
200 μl |
300 μl |
500 μl |
1 ml |
實驗步驟(以96孔板,HK2貼壁細胞為例)
細胞培養(yǎng)
取對數(shù)生長期細胞,以每孔4×103~1×105細胞接種于96孔板中,培養(yǎng)至正常狀態(tài)。
EU標記
1、將細胞完全培養(yǎng)基中按照500:1的比例加入EU溶液,制成2×EU標記培養(yǎng)基;
2、提前將2×EU標記培養(yǎng)基預熱,然后等體積加入到細胞原有培養(yǎng)基中,獲得1×EU溶液,其中EU的終濃度為500 μM;
注:1)我們不建議替換全部培養(yǎng)基,因為這樣可能會影響細胞增殖的速度;
2)配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配,用量以沒過細胞為宜;
3、每孔加入300 μl含EU培養(yǎng)基孵育細胞2小時,棄培養(yǎng)基;
注:1)培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài);
2)孵育時間至少2小時,可延長至24小時后再檢測也可以。
4、以1×PBS清洗細胞兩次,每次5分鐘,以除去未摻入RNA的EU殘留。
注:貼壁不牢的細胞可降低清洗強度。
細胞的固定和通透
1、每孔加入150 μl 細胞固定液,室溫培養(yǎng)30分鐘,棄固定液;
注:1) 該試劑盒配備了細胞固定液,也可以使用含4%多聚甲醛的PBS來進行細胞固定;
2) 如果使用其他的細胞固定劑建議用DEPC水來配置,避免RNA酶降解細胞內的RNA。
2、每孔加入150 μl 2mg/ml 甘氨酸,搖床孵育5分鐘;
3、棄甘氨酸溶液,每孔加入300 μl PBS洗液,室溫清洗5分鐘;
4、每孔加入300 μl 0.5% Triton X-100細胞通透液,室溫通透10分鐘,棄細胞通透溶液;
5、每孔加入300 μl PBS洗液,室溫清洗5分鐘;
EU染色
1、通過用10:1去離子水稀釋10×反應緩沖液進行配制1×EU 反應緩沖液;
2、按照溶解200 mg緩沖添加劑溶于1 ml去離子水的比例稱取適量的粉末進行溶解,即為可用的緩沖添加劑的濃度,建議現(xiàn)用現(xiàn)配;
注:緩沖添加劑為白色粉末,較難準確稱量,稱量范圍可稍微放寬,但是不應超過±20%,且該粉末較易氧化,使用后請旋緊管蓋,如試劑出現(xiàn)棕黃色,則需報廢或更換。
按照以下的表格進行染色反應液的配制:
染色反應液組分 |
500 μl |
1 ml |
2 ml |
5 ml |
1×反應緩沖液 |
430 μl |
860 μl |
1.8 ml |
4.3 ml |
催化劑溶液 |
20 μl |
40 μl |
80 μl |
200 μl |
TAMRA紅色熒光溶液 |
1.2 μl |
2.5 μl |
5 μl |
12.5 μl |
緩沖添加劑 |
50 μl |
100 μl |
200 μl |
500 μl |
3、每孔加入100 μl 配置好的檢測混合液,以覆蓋細胞為宜,避光、室溫孵育30分鐘;
4、棄染色反應液,加入100 μl 0.5% Triton X-100細胞滲透液清洗2-3次,每次10分鐘;
5、棄細胞滲透液,用PBS洗兩次,每次5分鐘。
DNA染色
1、將Hoechst 33342用RNase-free水溶液1:1000進行稀釋得到終濃度為5 μg/ml的1×Hoechst染色液;
2、每孔加入100 μl 1×Hoechst染色液,室溫避光孵育20-30分鐘后,棄染色液;
3、每孔加入100 μl PBS洗細胞兩次,去掉洗液。
圖像獲取及分析
建議染色完成后立即進行熒光顯微鏡拍照觀察;如果條件限制,請于4°C條件下避光濕潤保存3天之內完成拍照。若為細胞爬片或涂片,可使用抗熒光淬滅封片劑進行封片后于4°C條件下保存及拍照檢測。