快速鼠尾基因型鑒定（PCR法）試劑盒
快速鼠尾基因型鑒定（PCR法）試劑盒
發(fā)布日期：2019-09-10 瀏覽次數(shù)：252
快速鼠尾基因型鑒定（PCR法）試劑盒
說明書
產(chǎn)品組分
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組分名稱 |
M00301-100T |
M00301-500T |
M00301-1000T |
存儲條件 |
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鼠尾裂解液 |
10 ml |
25ml×2 |
25ml×4 |
4°C |
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蛋白酶K |
1 ml |
1 ml×5 |
1ml×10 |
-20°C |
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2×PCR Easy Mix |
1ml |
1ml×5 |
1ml×10 |
-20°C |
實(shí)驗(yàn)方法
1、組織消化
1.1按照小鼠數(shù)量配制組織消化液，試劑比例如下：
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單樣本 |
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蛋白酶K |
10 μl |
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鼠尾裂解液 |
100 μl |
組織消化液現(xiàn)用現(xiàn)配，充分混勻后使用。
1.2 向每個(gè)含有樣本的EP管中加入100 μl新鮮組織消化液，55°C水浴/金屬浴中消化30分鐘。組織消化時(shí)，請務(wù)必將組織完全浸沒于消化液中。消化完成后，組織外觀上依然完整，但足量的基因組DNA已經(jīng)釋放，不影響后續(xù)的PCR實(shí)驗(yàn)。
1.3 將樣本置于95°C水浴/金屬浴中孵育5分鐘以滅活消化液中蛋白酶。12000rpm離心5分鐘，取上清作為PCR模板。消化后的上清可于-20°C保存三個(gè)月。
2、PCR擴(kuò)增
2.1 PCR反應(yīng)體系的配制：
于低溫環(huán)境下（如冰浴中）完成，以保證PCR擴(kuò)增效率和特異性。
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PCR反應(yīng)組分 |
20 μl反應(yīng)體系 |
50 μl反應(yīng)體系 |
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模板（消化產(chǎn)物） |
2 μl |
5 μl |
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正向引物（10 μM） |
0.5 μl |
1 μl |
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反向引物（10 μM） |
0.5 μl |
1 μl |
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2×PCR Easy Mix |
10 μl |
25 μl |
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ddH2O |
7 μl |
18 μl |
2.2 PCR反應(yīng)條件：
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溫度（°C） |
時(shí)間 |
循環(huán)數(shù) |
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94 |
5 min |
1 |
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94 |
20 sec |
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50-65 |
30 sec |
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72 |
X min (1kb/min) |
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72 |
5 min |
1 |
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4 |
-- |
1 |
3、瓊脂糖凝膠電泳
試劑中含有溴酚藍(lán)染料，PCR產(chǎn)物可以直接點(diǎn)樣進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。另外PCR產(chǎn)物的3’端帶有堿基A，可直接克隆至T載體，用于DNA測序。
常見問題及對策分析
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常見問題 |
可能原因 |
對策 |
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樣本組與陽性對照組均無擴(kuò)增條帶 |
PCR反應(yīng)條件設(shè)置不當(dāng) |
優(yōu)化PCR反應(yīng)條件 |
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PCR引物質(zhì)量問題 |
重新設(shè)計(jì)PCR引物 |
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樣本組無擴(kuò)增條帶而陽性對照組正常 |
不當(dāng)儲存或長期儲存引起試劑活性喪失 |
使用新鮮的試劑 |
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組織消化不夠充分 |
延長55°C消化時(shí)間至60min |
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蛋白酶未被完全滅活 |
消化產(chǎn)物在95°C孵育5min |
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存在非特異性擴(kuò)增條帶 |
PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高 |
增加PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度 |
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PCR引物錯(cuò)配 |
重新設(shè)計(jì)PCR引物 |
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配制PCR反應(yīng)體系時(shí)溫度太高或配制完成后放置時(shí)間太久 |
PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后請盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng) |
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