產(chǎn)品簡介
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征,它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和一些疾病發(fā)生過程等方面起著十分重要的作用。Annexin V 是檢測早期細(xì)胞凋亡的*靈敏指標(biāo)之一。正常細(xì)胞中,磷脂酰絲氨酸 (PS)只分布在細(xì)胞膜磷脂雙分子層的內(nèi)側(cè),而在細(xì)胞凋亡早期,細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸發(fā)生外翻,暴露于細(xì)胞質(zhì)膜的外側(cè)。在體內(nèi),巨噬細(xì)胞可以識別翻轉(zhuǎn)的 PS,從而將這些程序性細(xì)胞凋亡的細(xì)胞**,因此凋亡過程中并不伴隨局部的炎癥反應(yīng)。Annexin V 是一種分子量為35-36kD 的與磷脂酰絲氨酸有高度親和力的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,因此能夠利用 Annexin V 與細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸相結(jié)合的性質(zhì),檢測細(xì)胞的早期凋亡。將 Annexin V 進行綠色熒光 (FITC) 標(biāo)記,以標(biāo)記了的 Annexin V-FITC 作為探針, 利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶 (PI)是一種核酸染料,它不能透過具備完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞,但能夠透過凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而將細(xì)胞核染色,在特定激發(fā)光條件下呈現(xiàn)紅色。
將 Annexin V-FITC 與 PI 匹配使用,就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上,若橫坐標(biāo)表示 Annexin V 信號,縱坐標(biāo)表示PI 信號,則左下象限 (Annexin V-/PI-) **活細(xì)胞;右下象限(Annexin V+ /PI-) **早期凋亡細(xì)胞;右上象限(Annexin V+ /PI+)**凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞;左上象限(Annexin V-/PI+) 被認(rèn)為是許可范圍內(nèi)的檢測誤差。
利用流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡檢測懸浮細(xì)胞或者貼壁細(xì)胞中的綠色熒光信號(Annexin V-FITC)以及紅色熒光信號(PI)。
該產(chǎn)品能夠在極短的時間內(nèi)方便、高效、準(zhǔn)確的區(qū)分正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死的細(xì)胞,并計算各群細(xì)胞的比例。
產(chǎn)品組分
編號 |
組分 |
C01201-20T |
C01201-50T |
C01201-100T |
C01201-A |
Annexin V-FITC 染色液 |
100 μl |
250 μl |
500 μl |
C01201-B |
PI 染色液 |
200 μl |
500 μl |
1ml |
C01201-C |
結(jié)合緩沖液(1×) |
10ml |
25ml |
50ml |
藍(lán)冰運輸。-20℃避光長期保存,避免反復(fù)凍融。如短時間內(nèi)需多次重復(fù)使用, 請于 4℃避光保存,有效期半年。
1、螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請低速短暫離心,將管內(nèi)壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體灑落造成損失。
2、細(xì)胞處理需小心操作,避免人為的損傷細(xì)胞。
3、細(xì)胞凋亡是一個快速和動態(tài)的過程,因此建議在染色后立即進行分析。
4、Annexin V-FITC 和 PI 是光敏感物質(zhì),在操作時應(yīng)注意避光,盡量減少暴露在光下的時間,必要時請使用帶蓋子的冰盒或者鋁箔紙進行避光操作。
5、使用該試劑盒檢測凋亡是針對活細(xì)胞,不需要固定細(xì)胞,否則會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。
6、如果細(xì)胞樣品中含有血小板,請使用含有 EDTA 的緩沖劑并低速離心洗去血小板后再進行檢測,因為血小板含有 PS,能夠與 Annexin V 結(jié)合。
7、對于貼壁細(xì)胞,消化是一個關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡時如有漂浮細(xì)胞, 需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色,操作過程中需嚴(yán)格控制胰酶的消化時間,
時間過短,細(xì)胞需要用力吹打才能夠脫落,容易造成細(xì)胞膜的損傷,使得 PI 攝入過多;消化時間過長,細(xì)胞膜同樣會產(chǎn)生損傷,甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上的 PS 與 Annexin V 的結(jié)合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后,輕搖使胰酶與細(xì)胞充分解除,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余的少量胰酶再消化一段時間,待細(xì)胞空隙增大,瓶底呈花斑狀即可終止。
8、如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶,需注意用 PBS 洗凈去除殘留的胰酶,因為胰酶會消化并降解 Annexin V-FITC,*終導(dǎo)致染色失??;
9、盡量避免在消化液中使用 EDTA 或者 EGTA,因為 EDTA 和 EGTA 會螯合鈣離子,而 Annexin V 與 PS 的結(jié)合是依賴于鈣離子的,因此這兩種物質(zhì)的存在或者殘留會影響 Annexin V 與 PS 的結(jié)合,進而影響信號的檢測。
10、成功的檢測凋亡受以下幾種因素的影響,如細(xì)胞類型、細(xì)胞膜上的 PS 的密度、發(fā)生凋亡時 PS 翻轉(zhuǎn)的比例、誘導(dǎo)凋亡的方法、所用試劑、誘導(dǎo)凋亡的時間以及實驗過程中機械損傷的程度等,把這些因素進行優(yōu)化對實驗成功與否非常重要。請根據(jù)實驗樣本和操作流程對這些步驟進行優(yōu)化后再進行檢測。
1、懸浮細(xì)胞:300 g,4°C 離心 5 分鐘收集細(xì)胞;
貼壁細(xì)胞:用不含 EDTA 的胰酶進行消化后,300 g,4°C 離心 5 分鐘收集細(xì)胞。胰酶的消化時間不宜過長,以防引起假陽性。
2、用預(yù)冷的 PBS 溶液洗滌細(xì)胞兩次,每次均以 300 g,4°C 離心 5 分鐘收集細(xì)胞,并盡量去除 PBS 溶液。(可以用大 Tip 上套上小 Tip 去盡量去除 PBS 溶液)
3、加入 100 μl 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。
4、加入 5 μl Annexin V-FITC 染色液和 10 μl PI 染色液,輕輕混勻。
5、室溫、避光孵育 10-15 分鐘。
6、再加入 400 μl 結(jié)合緩沖液,混勻后置于冰上。
7、立即用流式細(xì)胞儀或者熒光顯微鏡進行檢測。
1、流式細(xì)胞儀分析
FITC 的激發(fā)波長不應(yīng)超過488 nm,發(fā)射波長不應(yīng)超過 525 nm,F(xiàn)ITC 的綠色熒光在FL1 通道檢測;PI-DNA 復(fù)合物的**激發(fā)波長為 535 nm,**發(fā)射波長為 615 nm, PI 的紅色熒光在 FL2 或 FL3 通道檢測。用分析軟件繪制雙色散點圖,F(xiàn)ITC 為橫坐標(biāo),PI 為縱坐標(biāo)。典型的實驗中,細(xì)胞可以分成三個亞群,活細(xì)胞僅有很低強度的熒光,早期凋亡細(xì)胞僅有較強的綠色熒光,晚期凋亡的細(xì)胞有綠色和紅色熒光的雙重染色。
2、熒光顯微鏡觀察
滴加 30-50 μl 用 Annexin V-FITC/PI 雙染色的細(xì)胞懸液于載玻片上,并用蓋玻片蓋上細(xì)胞,然后在熒光顯微鏡下用雙色濾光片進行觀察。Annexin V-FITC 的熒光信號呈綠色,PI 的熒光信號為紅色。因此 Annexin V-FITC 陽性的細(xì)胞將在細(xì)胞膜表面呈現(xiàn)明亮的綠色,而 PI 陽性的細(xì)胞則會在整個胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)不同強度的黃-紅色。早期凋亡的細(xì)胞只呈現(xiàn)綠色,而壞死和晚期凋亡細(xì)胞則會顯示黃-紅色的胞質(zhì),紅色的細(xì)胞核以及環(huán)繞細(xì)胞的綠色的胞膜,在晚期凋亡的細(xì)胞中還可以觀察到胞膜皺縮和起泡。
【注】:對于貼壁細(xì)胞,可直接用蓋玻片培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,然后染色后將蓋玻片置于載玻片上進行熒光顯微鏡觀察即可。
可能的原因如下:
1、確定實驗中的誘導(dǎo)劑是否能夠有效產(chǎn)生凋亡??梢酝ㄟ^設(shè)定確切凋亡誘導(dǎo)的陽**物對照來排除這一情況。
2、消化液中的胰酶或 EDTA 等是否去除干凈,建議使用無 EDTA 的胰酶進行消化,或者消化后用 PBS 徹底洗滌干凈。
3、細(xì)胞用預(yù)冷的 PBS 洗滌后,離心,應(yīng)盡量吸干殘余液體,因為 PBS 中含有的磷酸根離子會與結(jié)合緩沖液中的鈣離子形成磷酸鈣沉淀,進而影響 Annexin V 的染色。
4、結(jié)合緩沖液瓶蓋需蓋緊密封,長時間暴露于空氣中后,空氣中的二氧化碳會與鈣離子形成碳酸鈣沉淀,從而導(dǎo)致鈣離子濃度降低,導(dǎo)致實驗的結(jié)果不佳。
5、吸取完 PBS 的*頭如果不更換,繼續(xù)取結(jié)合緩沖液,也會導(dǎo)致結(jié)合緩沖液中游離鈣離子的減少,導(dǎo)致實驗結(jié)果不佳。
6、陽性細(xì)胞的丟失。如果是貼壁細(xì)胞,藥物誘導(dǎo)后漂浮細(xì)胞也應(yīng)該和貼壁細(xì)胞一起收集后合并檢測,漂浮細(xì)胞往往是凋亡陽性的細(xì)胞,否則丟失漂浮細(xì)胞會導(dǎo)致陽性結(jié)果偏低。
可能的原因如下:
1、細(xì)胞本身活力太差。若實驗中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導(dǎo)凋亡的對照細(xì)胞經(jīng)染色后Annexin V+/PI+雙陽性的細(xì)胞比例過高,可能的原因是細(xì)胞本身活力太差,建議用臺盼藍(lán)染色計算細(xì)胞活力,拒染細(xì)胞比例應(yīng)大于 95%;若活力偏低,建議重新復(fù)蘇細(xì)胞,剛剛復(fù)蘇的細(xì)胞至少要傳代 3 次以后才能進行該實驗。
2、細(xì)胞操作不當(dāng)。貼壁細(xì)胞消化過程中避免反復(fù)劇烈吹打?qū)е录?xì)胞膜破壞,假陽性偏高。
3、凋亡誘導(dǎo)時間過長。誘導(dǎo)時間過長會使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)耗盡,導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差, 假陽性偏高。