細胞增殖實驗

細胞增殖與細胞凋亡、細胞周期等是腫瘤研究的重要表型，是分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究解決的問題之一。通過在細胞中過表達或干擾某個基因研究基因?qū)毎鲋衬芰Φ挠绊?，進一步研究基因的功能，或?qū)毎M行藥物處理，研究藥物對增殖的影響。

1. MTT法：是一種檢測細胞存活和生長的方法。該方法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟、快捷。

原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。

2. CCK-8法:可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析，常用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。

原理：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

3. Brdu: 即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期，S期活體注射或細胞培養(yǎng)加入。而后利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細胞。同時結(jié)合其它細胞標記物雙重染色可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學(xué)有重要意義。

但由于抗體分子量大，難于摻入并被有效檢測。因此BrdU檢測需采用DNA酶或HCl或加熱使DNA變性。這些處理方法會破壞抗原識別位點，此外許多細胞周期分析的染料都需要dsDNA。這種處理方法也使得同一樣本無法同時進行細胞周期分析。對于植物細胞等有細胞壁的分析。采用抗體檢測還需要消化細胞壁，細胞壁消化酶常含有一些雜質(zhì)，會導(dǎo)致檢測的可靠性降低，同時BrdU檢測則需要進行長時間的孵育--幾個小時甚至過夜。

4. EDU: 即5-Ethynyl-2’- deoxyuridine, 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子中。通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測細胞DNA復(fù)制活性，適用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA修復(fù)、病毒復(fù)制、細胞標記示蹤等方面的研究，尤其適合進行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。

細胞凋亡

細胞凋亡是腫瘤和發(fā)育研究的重點，同時也是藥理學(xué)研究的熱點。細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自主結(jié)束其生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。

細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段：接受凋亡信號→凋亡調(diào)控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進入連續(xù)反應(yīng)過程。

ANNEXIN V-PI法: 在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin?V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin?V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。

將Annexin?V進行熒光素（EGFP、FITC）標記，以標記了的Annexin?V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium?Iodide,?PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin?V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。

細胞膜片鉗技術(shù)

膜片鉗技術(shù)被稱為研究離子通道的“金標準”。是研究離子通道的最重要的技術(shù)。目前膜片鉗技術(shù)已從常規(guī)膜片鉗技術(shù)（Conventional patch clamp technique）發(fā)展到全自動膜片鉗技術(shù)（Automated patch clamp technique）

原理：膜片鉗技術(shù)是用微玻管電極（膜片電極或膜片吸管）接觸細胞膜，以千兆歐姆以上的阻抗使之封接，使與電極尖開口處相接的細胞膜的小區(qū)域（膜片）與其周圍在電學(xué)上分隔，在此基礎(chǔ)上固定點位，對此膜片上的離子通道的離子電流（pA級）進行監(jiān)測記錄的方法。

用場效應(yīng)管運算放大器構(gòu)成的I-V轉(zhuǎn)換器是測量回路的核心部分。在場效應(yīng)管運算放大器的正負輸入端子為等電位，向正輸入端子施加指令電位時，由于短路負端子以及膜片都可等電位地達到鉗制的目的，當(dāng)膜片微電極尖端與默片之間形成10GΩ以上封接時，其間的分流電流達到最小，橫跨膜片的電流可100%作為來自膜片電極的記錄電流（lp）而被測量出來。

細胞遷移和侵襲

在腫瘤發(fā)展過程中，細胞進入循環(huán)系統(tǒng)的能力是重要的研究對象。相關(guān)的信號通路主要可以分為控制細胞黏附和控制細胞骨架。細胞的遷移與侵襲主要與細胞骨架和黏附相關(guān)。腫瘤細胞侵襲和遷移能力的改變通常采用Transwell進行檢測。細胞劃痕也是測定腫瘤細胞運動特性的方法，由于無法區(qū)別正常增殖和遷移細胞，應(yīng)用有局限性。

1.Transwell實驗

Transwell小室底層的一張有通透性的膜（一般為聚碳酸酯膜），將其放置于孔板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞。應(yīng)用Transwell可研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

腫瘤遷移實驗：研究腫瘤細胞的遷移能力或特定情況下腫瘤細胞的遷移能力。常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。

腫瘤侵襲實驗：研究腫瘤細胞的侵襲能力或特定情況下腫瘤細胞的侵襲能力。在聚碳酸酯膜上涂上一層基質(zhì)膠，模仿細胞外基質(zhì)，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，細胞要把基質(zhì)消化后才可以從上室遷移到下室，計數(shù)進入下室的細胞量測定細胞的侵襲能力。

?目的：研究目的基因過表達/干擾對細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響

?材料：正常細胞、對照慢病毒、過表達基因慢病毒

?步驟：細胞復(fù)蘇——Transwell鋪板——細胞培養(yǎng)及染色——拍照

?結(jié)果：

2. 劃痕實驗：

劃痕實驗檢測細胞遷移的原理：在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細胞上，用微量槍頭或其它硬物在細胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞至實驗設(shè)定的時間，取出細胞培養(yǎng)板，在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細胞的生長遷移能力。

實驗通常需設(shè)定正常對照組和實驗組,實驗組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通過不同分組之間的細胞對于劃痕區(qū)的修復(fù)能力，可以判斷各組細胞的遷移與修復(fù)能力。

細胞周期檢測

細胞周期（cell cycle）是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。細胞周期反應(yīng)了細胞增殖速度，單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。

原理：細胞周期各時相的DNA含量不同，通常正常細胞的 G0/G1期具有二倍體細胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI 即碘化丙錠，可以與細胞內(nèi)DNA 和RNA 結(jié)合，采用RNA酶將RNA消化后，通過流式細胞術(shù)檢測到的與DNA 結(jié)合的PI 的熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量的多少。

因此，通過流式細胞術(shù)PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區(qū)分為 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。

?目的：通過慢病毒感染獲得基因過表達的細胞株，利用PI染色法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期的變化。從而研究目的基因?qū)毎芷诘挠绊憽?/span>

?材料：目的細胞、病毒

?步驟：細胞準備——樣品收集——上機檢測——數(shù)據(jù)分析

?結(jié)果：

細胞克隆實驗

細胞克隆實驗原理：單個細胞在體外增殖6代以上（時間約1周以上），其后代所形成的細胞群體，稱為集落或克隆。每個克隆含有50個以上的細胞，大小在0.3 - 1.0mm之間。

細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù)， 但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖并形成克隆。只有同時具有貼壁和增殖活力的細胞才會形成克隆。克隆形成率反映細胞的獨立生存能力的強弱，用于評價細胞群體依賴性和增殖能力。

由于細胞生物學(xué)性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強?？寺⌒纬陕逝c接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在培養(yǎng)皿中，持續(xù)一周以上，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養(yǎng)。

?目的：通過目的基因過表達/干擾細胞組、空細胞組與陰性對照組(空病毒)克隆形成數(shù)量的統(tǒng)計學(xué)分析，研究基因?qū)毎后w依賴性和增殖能力的影響。

?材料：病毒和細胞株

?步驟：鋪板——細胞培養(yǎng)——觀察克隆，染色，計算克隆形成率

細胞粘附實驗

細胞粘附實驗實驗原理：細胞黏附性是維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基本條件，也是細胞運動和發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)因素，并且對細胞的增殖、分化有重要影響。通常可分為兩類，即細胞與細胞黏附和細胞與基質(zhì)黏附。

機體內(nèi)許多細胞，如上皮細胞，需要牢固地定在某處發(fā)揮功能；另一些細胞，如白細胞，活躍運動，就需要不斷調(diào)節(jié)細胞黏附。細胞黏附性的改變在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用。惡性腫瘤具有從原發(fā)瘤分離及在體內(nèi)擴散的能力，提示這些細胞在相互識別及黏附機制方面發(fā)生了改變。

實驗方法：

1、將4.5×105個Hep3B細胞/孔傳代于無菌6孔培養(yǎng)板中。

2、培養(yǎng)24h后，用Lipofectamine?TM?2000將37LRP?siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B細胞（兩個平行孔，Lipofectamine?TM?2000轉(zhuǎn)染具體操作見方法7），轉(zhuǎn)染后的細胞置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后收集細胞。同時各有兩個平行孔的細胞進行陰性對照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染終濃度即siRNA終濃度為100nmol/L。

3、培養(yǎng)48小時后收集細胞，用0.25%胰酶將貼壁培養(yǎng)細胞（約1×106個）從壁上消化下來并制成單細胞懸液。

4、用無血清MEM培養(yǎng)基將Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜膠備用。

5、96孔板每孔中鋪Matrigel?2ug/50ul，放于超凈臺中風(fēng)干過夜。