一、實驗原理

將Transwell小室放入配套培養(yǎng)板中，形成由細胞可穿透性膜分隔開的兩室系統，并將高營養(yǎng)液與低營養(yǎng)液分隔開，為進行侵襲實驗，在膜上室鋪基質膠（用由細胞外基質組成的凝膠堵塞膜中的孔，該凝膠旨在模擬腫瘤細胞在體內侵襲過程中遇到的典型基質），通過將細胞放置在凝膠的一側，將趨化劑放置在凝膠的另一側，侵襲細胞將降解鄰近基質并遷移通過ECM凝膠（基質降解與定向運動相結合，即侵襲），從而通過計數穿過細胞以檢測細胞侵襲能力。

由于Matrigel膠內含有層黏連蛋白、Ⅳ型膠原、纖連蛋白、硫酸肝素糖蛋白、觸角蛋白、TGF2β及生長因子等人體ECM的大多數成分，類似動物的基底膜。因此，可模擬最真實的體內環(huán)境，體外檢測細胞的侵襲性，間接反映體內腫瘤侵襲的能力。

請注意，該結構不是纖維蛋白，而是更偏向凝膠樣

二、實驗步驟

1. 實驗準備

提前12 h將Matrigel放到4℃融化，將實驗用到的槍頭、EP管等材料提前放到-20℃預冷；實驗前準備冰盒，整個實驗操作過程置于冰上進行；

2. 包被基底膜

在冰上將Matrigel膠用無血清的細胞培養(yǎng)基進行稀釋，混勻后加入小室中，注意動作輕柔，不要產生氣泡，將小室放入CO2培養(yǎng)箱中孵育2h備用；

3. 水化基底膜

將孵育完成的小室中上室多余的液體小心吸掉，每孔中加入100 μL無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中放置30 min。

4. 接種細胞

a. 將狀態(tài)良好的細胞進行消化，離心，用PBS洗1-2遍，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度至1-10×105/ml（需要做預實驗確定具體的細胞密度）；

b. 在下室中加入500μL的含10%FBS的培養(yǎng)基，將小室小心放入24孔板內，在上室中加入細胞懸液100 μL-200 μL，放入培養(yǎng)箱中（需要做預實驗確定具體的培養(yǎng)時間）。

5. 固定染色、拍照及計數

a. 到時間點后將小室取出，用PBS清洗小室，用棉簽輕柔擦去上室細胞和Matrigel后，用4%多聚甲醛固定或甲醇20 min，將小室適當風干，用0.1%結晶紫染色30 min，PBS清洗3遍，于37℃干燥。

b. 將小室置于顯微鏡下，隨機選取5個視野，拍照并計數。

三、注意事項

1. Matrigel使用說明

Matrigel應避免反復凍融，分裝時將整瓶Matrigel埋沒在碎冰盒中，再將冰盒置于4℃冰箱中，建議放在冰箱靠后的位置，放置過夜，避免使用冰箱門進行解凍，因為其內裝物的溫度在反復打開時會迅速上升，導致材料過早凝膠化。分裝后置于-20℃保存，長期保存可放于-80℃冰箱中；

2. 如何盡量避免增殖對結果的影響

如果在侵襲實驗期間發(fā)生了大量的增殖，那么計算出的絕對侵襲數據將受到影響。因此，侵襲實驗時間越短，增殖對數據的影響就越小。當然，實驗中的腫瘤細胞很可能在48或72小時內就會增殖，但如果每個治療組的增殖量是相似的，允許直接比較治療組之間的相對侵襲數據；

3. 小室的重復使用

很多實驗室會將小室進行重復利用，我們需要在用棉簽擦拭時避免用力，避免損傷小室膜，重復利用前應在鏡下觀察小室膜是否有裂縫。