原理

過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系（Overexpression Stable Cell Lines）的構(gòu)建利用慢病毒轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)等技術(shù)手段將特定的基因序列整合到宿主細(xì)胞的染色體上，使得目的基因能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)長期且穩(wěn)定的表達(dá)。

用途

基因功能研究 、免疫/殺傷/增殖等 、抗體藥物的活性篩選（細(xì)胞水平的結(jié)合和阻斷）、CAR 分子的殺傷活性評價(jià)。

材料與儀器

（以慢病毒 pMSCV 載體為例）包含目的基因和 eGFP-Tag 的 pMSCV 質(zhì)粒、帶有 eGFP-Tag 的 pMSCV 空載質(zhì)粒、GAG 質(zhì)粒、VSV 質(zhì)粒、Puromycin、Polybrene 、Lipo3000、HEK293T 細(xì)胞、opti-MEM、DMEM、FBS、雙抗、0.45 μm 的濾膜、熒光顯微鏡等。

步驟

1、基因的構(gòu)建

1) 根據(jù)目的基因 mRNA 編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，分別在引物兩端加入酶切位點(diǎn) EcoRI 和 Bgl II。

2) 從細(xì)胞中提取目的基因 mRNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后從 cDNA 里面用引物把目的基因的 CDS 區(qū)擴(kuò)增出來。PCR 擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的目的基因編碼區(qū)序列，連接至 pMD19-T 載體后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌 DH5α，分別進(jìn)行菌落 PCR 鑒定和酶切鑒定。

3) 使用 EcoRI 和 Bgl II 雙酶切下目的基因序列，電泳割膠回收純化，連接到 pMSCV-eGFP 載體。再次轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌 DH5α，菌落 PCR 鑒定和酶切鑒定成功后，送至公司測序、鑒定。

4) 鑒定成功后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌 DH5α 中，并進(jìn)行無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提。GAG 質(zhì)粒和 VSV 質(zhì)粒同樣可以轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌 DH5α 中，并進(jìn)行無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提。質(zhì)粒抽提后冷凍于 -20 ℃ 保存。

2、慢病毒包裝

1) 使用 DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng) 6 cm 皿 HEK293T 至匯合度為 70~80%。采用 opti-MEM 和 Lipo3000 分別轉(zhuǎn)染含有目的基因的 pMSCV-eGFP、VSV、GAG 質(zhì)粒及對照載體，每皿加入脂質(zhì)體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染混懸液按購買脂質(zhì)體相關(guān)說明書操作定量。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。

2) 24 小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為新鮮的 DMEM 完全培養(yǎng)基，放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 48~72 h。

3) 48~72 h 后收集上層培養(yǎng)液，并過 0.45 μm 濾膜，采用 ELISA 法對所獲得的慢病毒載體進(jìn)行病毒滴度測定。如不及時(shí)使用可以凍存于 -80 ℃。

3、慢病毒轉(zhuǎn)染

1) 轉(zhuǎn)染前 1 天將細(xì)胞接種 6 孔培養(yǎng)板，感染時(shí)細(xì)胞的融合率約為 50%，感染前需換液，加入 1 mL DMEM 完全培養(yǎng)基。

2) 病毒冰浴融化后加入相應(yīng)體積的病毒液及聚凝胺（Polybrene），混勻后放入 37 ℃ 孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)

3) 4 h 后補(bǔ)充 1 mL 培養(yǎng)基，14 h 后換液（24 h 內(nèi)換液即可）。

4) 病毒感染 72 h 后用倒置顯微鏡觀察熒光，監(jiān)測感染效率，出現(xiàn)較多熒光時(shí)將等量的轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別加入等濃度 Puromycin（Puromycin 或其他抗生素篩選濃度需要事先摸索）。

5) 待未轉(zhuǎn)染細(xì)胞全部死亡并且可觀察到滿意熒光量時(shí)，降低 Puromycin 濃度培養(yǎng)。也可以挑去單克隆細(xì)胞株進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，以得到滿意的穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株。

6) 使用 qRT-PCR 和 Western blot 的方法檢測目的基因的表達(dá)量和蛋白水平是否顯著提高。

7) 由此可得三組細(xì)胞株：a. 正常細(xì)胞株；b. 空載病毒載體感染的細(xì)胞株；c. 過表達(dá)目的基因的病毒載體感染的細(xì)胞。

8) 在后續(xù)培養(yǎng)傳代該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株時(shí)，培養(yǎng)基中需添加低濃度 Puromycin 做壓力篩選條件。

注意事項(xiàng)

1. 為避免慢病毒感染后細(xì)胞死亡，務(wù)必保證原始細(xì)胞無支原體污染。

2. 查閱壓力篩選條件在目標(biāo)細(xì)胞系中穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選的致死用量信息。

3. 查閱文獻(xiàn)確定慢病毒在目標(biāo)細(xì)胞系中的最佳滴度。

4. 轉(zhuǎn)染后可以進(jìn)一步進(jìn)行單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株培養(yǎng)，可采用稀釋法和培養(yǎng)皿挑取法。

5. 慢病毒轉(zhuǎn)染載體種類繁多，應(yīng)選擇適合目的細(xì)胞系的載體進(jìn)行病毒的包裝和轉(zhuǎn)染。

常見問題

轉(zhuǎn)染時(shí)病毒滴度較低

可以將 6 cm 皿培養(yǎng)的 HEK293T 更換為 10 cm 皿培養(yǎng)，或使用超速離心沉淀法或 PEG-8000 濃縮法提高病毒滴度。