染方法大致可分為物理介導(如電穿孔法、顯微注射和基因槍等)、化學介導(脂質體及其代替物、磷酸鈣等)和生物介導(各類病毒,包括腺病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒等)三類途徑。
細胞轉染又分為瞬時轉染和穩(wěn)定轉染,瞬時轉染是指外源基因進入受體細胞后,存在于游離的載體上,不整合到細胞的染色體上,基因表達維持時間較短,通常在96h以內;穩(wěn)定轉染是指DNA整合到宿主細胞的染色體中,使宿主細胞可長期表達目的基因。
目前,大多采用依據(jù)不同質粒載體含有的抗性標志選用相應的抗生素對靶細胞進行篩選,常用的抗生素有嘌呤霉素(Puromycin)、G418(Geneticin)等。
1、主要有下面幾種
化學法:磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質體法;
物理法:電穿孔法、顯微注射法、biolistic顆粒傳遞法;
病毒介導法:逆轉錄病毒、腺病毒
A. 陽離子脂質體法:帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞。
特點:簡單通用,適用性廣,轉染效率高,重復性好,但轉染時需除血清,轉染效率隨細胞類型變化大。由于脂質體復合物與貼壁細胞的接觸機會遠大于懸浮細胞,所以貼壁比懸浮轉染效率要高。懸浮細胞建議使用電穿孔法。
B. 電穿孔法:利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾,使其形成利于核酸進入的微孔。
C. 逆轉錄病毒(RNA):通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用進入宿主細胞,之后反轉錄酶啟動合成DNA并隨機整合到宿主基因組中。
特點:穩(wěn)定轉染,可用于難轉染的細胞、原代細胞,體內細胞等,但攜帶基因不能太大。
D. 腺病毒(雙鏈DNA):先和細胞表面的受體結合,繼而在αV整合素介導下被細胞內吞。
特點:可用于難轉染的細胞。
2、影響轉染的因素
血清:血清影響復合物的形成,降低轉染效率。
陽離子脂質體和DNA的最佳量在使用血清時會有所不同,因此想在轉染培養(yǎng)基中加入血清時要進行條件優(yōu)化。大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內保持健康。
抗生素:比如青霉素和鏈霉素,是影響轉染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導致轉染效率低。
細胞代數(shù):轉染前細胞最好經(jīng)過1-2次傳代保證細胞生長旺盛容易轉染,注意貼壁細胞一旦長滿就不好轉染。
細胞鋪板密度:一般轉染時,貼壁細胞密度為70%-90%,懸浮細胞密度為2*10^6--4*10^6 細胞/ml 時效果較好。確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。
DNA質量:DNA質量對轉染效率影響非常大。一般的轉染技術基于電荷吸引原理,如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成和轉染的進行。
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