原理
HE 染色主要使用蘇木精和伊紅這兩種染液,其中蘇木精堿性染液為藍色,可以將組織的酸性結(jié)構(gòu)染成藍紫色(細胞核呈現(xiàn)藍色;軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍;粘液呈灰藍);伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料,在水中解離成帶負電荷的陰離子,易于蛋白質(zhì)氨基中的正電荷結(jié)合使細胞漿染色。
細胞漿、肌肉、結(jié)締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色。
材料與儀器
小鼠、固定液、酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟
蘇木精染液、伊紅酒精溶液、鹽酸酒精溶液
甘油蛋白粘片劑、中性樹膠
石蠟包埋機、切片機、恒溫箱、蠟杯
酒精燈、解剖剪、培養(yǎng)皿、鑷子、單面刀片
染色缸、蓋玻片、載玻片、玻片盤、顯微鏡
溫度計、水浴鍋
步驟
一、制作卵巢石蠟切片
1、取材
小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉,頸椎脫臼法處死小鼠,取出雙側(cè)卵巢。取下所需組織,切成一小塊 3~4 mm 厚。
2、固定、洗滌、脫水
(1)將切好的卵巢組織用生理鹽水洗一下,使用中性福爾馬林固定液固定 30~50 min。后用流水沖洗 3 次,每次 5 min。
(2)卵巢組織依次經(jīng) 70%、80%、90% 乙醇溶液脫水,各 30 min。
(3)再放入 95%、100% 乙醇溶液各 2 次,每次 20 min。
3、透明、透蠟
(1)使用純酒精、二甲苯等量混合液處理組織 15 min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ各 15 min 至透明。
(2)放入二甲苯和石蠟等量混合液處理 15 min,再放入石蠟Ⅰ、Ⅱ透蠟各 50~60 min。透蠟在恒溫箱內(nèi)進行,箱內(nèi)溫度保持在 55~60 ℃ 左右。
4、包埋
(1)用鑷子夾取蠟?zāi)T诰凭珶羯仙约訜?,并倒入少許從溫箱中取出的純石蠟。
(2)再將鑷子在酒精燈上稍加熱,夾取材料將切面朝下放入蠟?zāi)V?,排列整齊,再放上包埋盒,輕輕倒入熔蠟。
5、切片、展片、貼片
(1)將包埋好的石蠟塊固定在切片機上,調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度,一般為 4~6 μm。
(2)切下的組織薄片要放到加熱的水中燙平,再貼到載玻片上,放 45 ℃ 恒溫箱中烘干。
二、HE 染色
1、脫蠟、復(fù)水
(1)保持水浴鍋溫度為 60 ℃,將切片放入干燥的染色缸內(nèi),放入水浴鍋中,30 min 至蠟熔化。
(2)石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各 5 min,然后放入 100%、95%、90%、80%、70% 各級酒精溶液中各 3~5 min,再放入蒸餾水中 3 min,以便染料可以進入組織。
2、染色、脫水
(1)切片放入蘇木精中染色約 10~30 min,用流水沖洗約 15 min,使切片顏色變藍。
(2)將切片放入 1% 鹽酸乙醇液中褪色,幾秒后見切片變紅、顏色較淺即可,后將切片再放入流水中使其恢復(fù)藍色。
(3)切片放入 50%、70%、80% 乙醇中各 3~5 min,用 0.5% 伊紅乙醇液對比染色 1~3 min。
(4)將切片放入 95% 乙醇中洗去多余的紅色,然后放入無水乙醇中 3~5 min,吸干后將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各 3~5 min。
3、觀察
在鏡下可見卵巢呈扁橢圓形,表面為單層扁平上皮細胞或單層立方上皮,卵巢實質(zhì)分為皮質(zhì)和髓質(zhì)??梢娚掀?,原始卵泡和生長卵泡。卵巢組織中各發(fā)育階段卵泡及卵巢基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見, 細胞核呈藍紫色, 細胞質(zhì)及間質(zhì)成分呈淺紅色, 卵泡中卵母細胞、卵泡細胞、透明帶均清晰可見。
注意事項
1. 取材注意事項
(1)取材動作要迅速,不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。
(2)切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進行選擇,盡可能不要損傷所需要的部分。
(3)切取的組織塊不宜太大,以利于固定劑穿透,通常以 5 mm x 5 mm x 2 mm 或 10 mm x 10 mm x 2 mm 為宜。
2. 固定注意事項
(1)一般固定液,都以新配為好,配好后應(yīng)貯存在陰涼處,不宜放在日光下,以免引起化學(xué)變化,失去固定作用。
(2)有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定時就沒有作用了。
(3)固定材料時,固定液必須充足,一般為材料塊的 20~30 倍,有些水分多的材料,中間應(yīng)更換 1~2 次新液。
(4)材料固定完畢后,保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里,同時在容器外上標簽,并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標簽,以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽上的文字,應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。
3. 脫水注意事項
(1)脫水原理:乙醇與石蠟不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟。當組織中全部被二甲苯占有時,光線可以透過,組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。
(2)脫水必須在有蓋的玻璃品中進行,防止吸收空氣中的水分。
(3)在更換高一級的脫水劑時,最好不要移動材料以免損壞,可用吸管吸出器皿中的脫水劑,再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液,然后于皿中加入高一級脫水劑。
(4)在低濃度酒精中,每級停留不宜太長,否則易使組織變軟,助長材料的解體。
(5)在高濃度或純酒精中,每級停留的時間也不宜太長,否則會使組織變脆,影響切片。
(6)如需過夜,應(yīng)停留在 70% 酒精中。
(7)脫水必須徹底,否則不易透明,甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象。
4. 透明注意事項
(1)使用透明劑時,要隨時蓋緊蓋子,以免空氣中的水分進入。
(2)更換每級透明劑,動作要迅速,一方面為了不使材料塊干涸,另一方面能避免吸收濕氣。
(3)在透明過程中,如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀,說明材料中的水未被脫凈,應(yīng)退回純酒精中重新脫水,然后再透明,否則切片難以鏡檢。
(4)二甲苯應(yīng)盡量保持無水,應(yīng)經(jīng)常更換,或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。
5. 透蠟注意事項
(1)透蠟的目的是除去組織中的透明劑(如二甲苯等),使石蠟滲透到組織內(nèi)部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織大小而定。
(2)盡量保持在較低溫度中進行,以石蠟不凝固為度。
(3)透蠟溫度要恒定,不可忽高忽低。
(4)操作要迅速,力求在最短的時間內(nèi)完成石蠟透入過程,以免引起組織變硬、變脆、收縮等。
(5)注意溫度不要過高,以免組織發(fā)脆。
6. 染色水洗注意事項
(1)染色原理:伊紅主要染細胞質(zhì),著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細胞核的濃淡相配合,如果細胞核染色較濃,細胞質(zhì)也應(yīng)濃染,以獲得鮮明的對比。
(2)染色時間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低,適當縮短或延長。室溫高時促進染色,染色時間可短些,否則可適當延長時間,冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。
(3)注意流水不能過大,以防切片脫落。
(4)如果細胞核染色較淺,細胞質(zhì)也應(yīng)淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染,促使細胞質(zhì)容易著色,并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。
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