流式細胞術(shù)廣泛用于分析細胞表面和細胞內(nèi)分子的表達、鑒定并確定異質(zhì)細胞群中的不同細胞類型、評估分離亞群的純度以及分析細胞大小和容積。
主要用于測定熒光標記的抗體檢測蛋白產(chǎn)生的熒光強度，或結(jié)合了特定細胞分子的配體，如碘化丙啶與 DNA 的結(jié)合。
其染色過程包括從細胞培養(yǎng)物或組織樣品制備單細胞懸液。然后將獲得的細胞培養(yǎng)在包含未標記或熒光標記抗體的試管或多孔板中，再用流式細胞儀分析。
流式細胞儀主要有兩型：
臨床型（又稱：小型機、臺式機）和綜合型（又稱：大型機、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新產(chǎn)品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL，B-D公司最新產(chǎn)品為FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型；EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測分析功能外，還具有細胞分選功能，多用于科學研究。
流式細胞儀主要技術(shù)指標
1.流式細胞儀的分析速度：
一般流式細胞儀每秒檢測1000～5000個細胞，大型機可達每秒上萬個細胞；
2.式細胞儀的熒光檢測靈敏度：
一般能測出單個細胞上<600個熒光分子，兩個細胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分；
3.前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：
前向角散射（FSC）反映被測細胞的大小，一般流式細胞儀能夠測量到0.2μm～0.5μm；
4.流式細胞儀的分辨率：
通常用變異系數(shù)CV值來表示，一般流式細胞儀能夠達到<2.0%，這也是測量標本前用熒光微球調(diào)整儀器時要求必須達到的；
5.流式細胞儀的分選速度：
一般流式細胞儀分選速度＞1000個/秒，分選細胞純度可達99%以上；
流式細胞儀：射流
圖 1.流式細胞儀概覽。鞘液使細胞懸液聚攏，依次通過激光束，一次僅一個細胞。檢測器會檢測前向和側(cè)向散射光，以及染色細胞發(fā)射的熒光。
當細胞懸液通過流式細胞儀時，從小噴嘴中流出的細胞懸液在鞘液的流體力學作用下向中心聚攏。形成的細流可使細胞依次通過激光束，一次僅一個細胞（圖 1）。
當細胞通過激光束時，檢測器會檢測細胞或顆粒的散射光。前面的檢測器檢測前向散射光 (FS)，放置在側(cè)面的多個檢測器檢測側(cè)向散射光 (SS)，熒光檢測器則檢測被染色的細胞或顆粒發(fā)射的熒光。
流式細胞儀：前向和側(cè)向散射光的測定
細胞或顆粒通過光束并使光散射，這些散射光將以 FS 或 SS 的形式檢測。FS 與細胞的大小相關(guān)，SS 則與細胞顆粒度成比例。因此，通?？筛鶕?jù)細胞大小和顆粒度差異區(qū)分細胞群。
圖 2.綠色激光打到細胞上時的光散射。光的散射方向與細胞大小和顆粒度有關(guān)。
血液樣本流經(jīng)流式細胞儀的情況可有力地說明散射光與細胞的關(guān)系。
尺寸和顆粒度較大的粒細胞形成一個較大的細胞群，SS 和 FS 都很強，單核細胞尺寸較大，但其顆粒度較小，因此形成一個單獨的群，F(xiàn)S 較強但 SS 較弱，較小的淋巴細胞和淋巴母細胞也行成一個單獨的群，F(xiàn)S 較弱。由于這兩種細胞都不是顆粒細胞，因此產(chǎn)生的 SS 也較弱。
因此，根據(jù)不同的 FS 和 SS 可將這些細胞分成不同的細胞群。
圖 3.FS 與 SS 散點圖。每一個散點到代表被流式細胞儀檢測到的一個單細胞，不同細胞群的特征位置依據(jù)細胞大小和顆粒度確定。參考圖片出處：Riley 和 Idowu，Principles and Applications of Flow Cytometry（流式細胞術(shù)的原理和應(yīng)用）*。
流式細胞儀：散射光和熒光的測定
與根據(jù) FS 和 SS 區(qū)分細胞群類似，可根據(jù)是否表達特定蛋白區(qū)分細胞。這種情況下，通常使用熒光染料對目標蛋白進行染色。用于檢測目標蛋白的熒光染料被相應(yīng)激發(fā)波長的激光激發(fā)后會發(fā)射熒光。這些被熒光染色的細胞或顆粒會被單獨檢測。
受流式細胞儀中一組濾光片和鏡子的作用，前向和側(cè)向散射光以及染色細胞發(fā)射的熒光會被分成既定的波長并分配通道。熒光會被過濾，以使各傳感器僅檢測特定波長的熒光。這些傳感器稱為光電倍增管 (PMT)。
圖 4.熒光會被過濾，以使各 PMT 僅檢測特定波長的光。PMT 會將光子能量轉(zhuǎn)換成電信號，即電壓。
如圖 4 所示，F(xiàn)ITC（異硫氰酸熒光素）通道中，PMT 僅檢測 FITC 發(fā)射的波長在 519 nm 附近的光。PE 通道中，PMT 僅檢測 PE（藻紅蛋白）發(fā)射的波長在 575 nm 附近的光。各 PMT 還會檢測其他的熒光染料，這些染料發(fā)射的熒光波長與其要檢測的熒光染料發(fā)射的熒光波長相似。
流式細胞儀中裝有一組濾光片，以將相應(yīng)波長的光子引導至特定的 PMT 上（圖 5）。
圖 5.流式細胞儀中的濾光片。帶通 (BP) 濾光片允許較小范圍波長的光子通過，短通 (SP) 濾光片允許特定波長以下的光子通過，
長通 (LP) 濾光片則允許特定波長以上的光子通過。雙色向濾光片/鏡子（如雙色向 LP 鏡子）面向光束 45° 角放置。
對于長通雙色向濾光片，特定波長以上的光子可直接通過，特定波長以下的光子成 90° 角反射。
信號測定
當帶熒光的細胞通過激光束時，會隨著時間產(chǎn)生發(fā)射光峰或脈沖。它們將被 PMT 檢測并轉(zhuǎn)換成電壓脈沖，這就是事件。流式細胞儀會檢測總脈沖高度和面積，并將測得的電壓脈沖直接與該事件的熒光強度相關(guān)聯(lián)。
圖 6.PMT 將檢測熒光細胞每次釋放的光子產(chǎn)生的電壓脈沖面積。當沒有熒光標記的細胞通過光學元件時，不會發(fā)射光子，也不會檢測到信號。當熒光標記的細胞通過光學元件時，會受到激光照射并發(fā)射光子，因此檢測到的電壓強度會逐漸增強。隨著熒光細胞逐漸通過激光束，會隨著時間變化產(chǎn)生一段電壓脈沖。
通過積分各時刻脈沖的高度值得到脈沖面積，這由模數(shù)轉(zhuǎn)換器 (ADC) 的速度決定，也就是 10 MHz（即每秒 1000 萬次或每微秒 10 次）。
依據(jù)事件的脈沖強度（脈沖面積）為事件分配通道。增大通過 PMT 的電壓可以對信號進行放大。
圖 7.利用通道號和事件數(shù)繪制的單參數(shù)直方圖。X 軸為用對數(shù)表示的通道。
根據(jù)測得的信號強度為每一事件分配通道號；熒光強度越高，事件的通道號就越大。
圖 8.陰性和陽性結(jié)果的熒光強度測定值。左側(cè)的陰性結(jié)果表明沒有染色的細胞且各事件的熒光強度都很低，右側(cè)的陽性結(jié)果表明存在大量熒光強度很高的事件。
在陽性結(jié)果中，可以看出陰性對照和陽性樣品間強度結(jié)果有所不同（圖 9）。
圖 9.人 PBMC 細胞對單核細胞設(shè)門的抗-CCR2 抗體 (ab21667) 染色結(jié)果。數(shù)據(jù)來自匿名 Abreview
抗體染色
直接染色：
在直接免疫熒光染色中，將細胞與直接偶聯(lián)到熒光染料（如 FITC）的抗體一同培養(yǎng)。該染色法僅需一步抗體培養(yǎng)，且消除了二抗的非特異性結(jié)合。
對于包含二抗的大型抗體 - 熒光染料復(fù)合物可能被捕獲而導致非特異性結(jié)合或無法進入細胞防止一抗檢測的細胞內(nèi)染色非常適用。
間接染色：
在間接染色中，一抗未用熒光標記，而是通過熒光標記的二抗進行檢測。第二種試劑可以是能與一抗特異性結(jié)合的抗體。此外，還可使用親和素 - 生物素體系，這種方法將抗體偶聯(lián)到生物素上，再通過熒光染料標記的親和素進行檢測。
由于目前可用的偶聯(lián)抗體種類很多，這種方法可以將多種不同靶標產(chǎn)生的未偶聯(lián)一抗用于與熒光標記的二抗結(jié)合，以進行 FACS 分析。這大大提高了研究人員的可選靶標蛋白范圍。
細胞內(nèi)染色：
用于流式細胞術(shù)的細胞內(nèi)抗原染色方案取決于可讓抗體接近內(nèi)部細胞蛋白的固定和透化方法。無論何種情況，成功的染色都離不開通過抗體滴定進行的實驗條件優(yōu)化、使用適合的對照正確設(shè)置流式細胞儀以及優(yōu)化的固定和透化步驟。
分泌蛋白的檢測：
分泌蛋白的檢測十分困難，因為蛋白會在檢測前從細胞中釋放出來且可能快速降解。高爾基體阻斷劑（如布雷非德菌素A）可用于抑制表達蛋白的分泌，使其仍保留在高爾基體中。然后再用細胞內(nèi)染色法檢測靶標蛋白。
熒光染料偶聯(lián)劑的選擇
給定的抗體能否從陰性信號中分辨陽性信號取決于所用的熒光染料偶聯(lián)劑。
各熒光染料的相對強度一般指導原則是，從亮到暗依次為：PE、PE-Cy 7、PE-Cy5、APC、APC-Cy7、Alexa Fluor 647?、Alexa Fluor 700?、FITC、Pacific Blue 和 Alexa Fluor 488?。這是一般排序，個別抗體的相對強度可能有所差異。
高度表達的抗原通常可被檢測且與陰性對照區(qū)分開來，無論使用何種熒光染料。表達較少的抗原需要較亮的 PE 或 APC 偶聯(lián)劑提供的高信號背景比，以將陽性細胞完全從未染色的細胞中區(qū)分開來。
相對熒光染料強度取決于使用的儀器，因為不同儀器中的激光和濾光片組合會有所差異。因此，需要確保選用了合適的 FACS 儀器。
