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200kd的大蛋白western blot的實驗

200kd的大蛋白western blot的實驗要求是怎樣的呢,上海東寰為您介紹。
200kd的大蛋白western blot的實驗

A1:首先使用6-8%的分離膠,其次電轉(zhuǎn)時間適當(dāng)延長,250mA,90分鐘左右。如果同時需要跑一些分子量小的蛋白,最好將大小兩種膜分開轉(zhuǎn)膜

A2:注意以下問題:1、 緩沖液中加甲醇的作用是使SDS游離出來,并增加膜結(jié)合蛋白的量,但過多的甲醇會使膠收縮,造成大分子在凝膠中的沉淀而降低轉(zhuǎn)膜效率。大分子量的蛋白質(zhì)(如大于60kDa)應(yīng)使用低濃度的甲醇或不使用甲醇。

2、 電轉(zhuǎn)移效果檢查方法:①考馬斯亮蘭染色電轉(zhuǎn)移后的凝膠,檢查是否還有蛋白質(zhì)存留;②麗春紅染色,檢查膜是否吸附了蛋白質(zhì)。

3、 濕式電轉(zhuǎn)方法效率高,半干式電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)移速度較快。

4、 阻斷劑有BSA、Tween-20、脫脂奶粉和其他動物的血清等多種,阻斷的效果不盡相同,如果實驗中發(fā)現(xiàn)背景過高,可以嘗試更換阻斷劑。

5、 一抗和酶標(biāo)二抗的濃度十分重要,濃度過高,造成背景過高;濃度過低造成靈敏度偏低,實驗中應(yīng)根據(jù)一抗和酶標(biāo)二抗的效價,對此參數(shù)進行優(yōu)化。此外,一抗的質(zhì)量十分關(guān)鍵,抗體特異性和效價直接影響實驗結(jié)果。

6、 須嚴(yán)格控制假陽性反應(yīng),可使用免疫前血清作為陰性對照,同時要以抗原作為絕對的陽性對照,準(zhǔn)確確定陽性條帶的位置。

A3:6%左右的膠,電泳的話得試一下,80V,先跑半小時,然后100V跑半小時,0.45mm 的PVDF膜,轉(zhuǎn)膜普通轉(zhuǎn)膜液350MA,90分鐘左右