原理

以慢病毒包裝為例，主要包括 3 個質粒：質粒 DNA 可以轉錄出慢病毒遺傳物質（RNA），但不能翻譯出慢病毒的外殼及蛋白成分的載體質粒，其同時含有目的基因和報告基因，psPAX2 是可以表達慢病毒外殼的質粒，其表達產物可通過粘附機制更易穿過細胞膜。

pMD2.G 為慢病毒的膜蛋白質粒，通過脂質體進行三質粒共轉到靶細胞基因組中，宿主基因組在表達時，隨宿主基因轉錄出的目的基因 RNA 與 psPAX2、pMD2.G 基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。病毒進入細胞后，其遺傳物質 RNA 逆轉錄出 DNA，該基因再整合到靶細胞的基因組中，完成轉染過程。

因為質粒 DNA 只能轉錄出病毒 RNA 和表達目的基因卻不能表達出病毒的外殼和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一樣在宿主細胞能反復增殖，故對宿主細胞是無害的并且高效的將目的基因轉染到靶細胞基因組中。

用途

病毒產生，包裝病毒。

材料與儀器

無菌 1 × PBS，對數(shù)期 293T 細胞，細胞計數(shù)器，病毒質粒（以慢病毒為例：psPAX2/pMD2.G/載體質粒），轉染試劑（lipMax 或者 lipo3000），Poly brene、病毒濃縮液（生物公司有售）等。

步驟

（1）293T 細胞鋪板

取對數(shù)生長期的 293T 細胞，用 0.05% 的胰蛋白酶消化 293T 細胞，計數(shù)。

若是 10 cm 大皿，建議按照 10-12 × 106 每皿的數(shù)量將 293T 細胞均勻鋪入。

若是 6 孔板，建議按照 2 × 106 每孔的數(shù)量將 293T 細胞均勻鋪入。

（2）第二天：在 24 小時之內，觀察 293T 細胞的匯合度在 90%~95% 之間時，向其中加入 DNA-脂質體復合體，DNA-脂質體復合體制備方法如下：

a）輕輕混勻 LipoMax，根據(jù)說明書加入相應量于 500 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基中，混合均勻并置于室溫 5 分鐘。

b）在 500 μl Opti-MEM 無血清培養(yǎng)基中稀釋 DNA，總質量為 15 μg 按照載體質粒 : psPAX2 : pMD2.G = 4 : 3 : 1 的比例加入 DNA。

c）將稀釋后的 LipoMax 和稀釋后的 DNA 輕輕混勻，常溫靜置 20 分鐘，形成 DNA-LipoMax 復合體。

（3）將 DNA-LipoMax 復合體輕柔地滴加至細胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿混勻，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（4）病毒收集

濃縮病毒：加入 DNA-LipoMax 復合體 48 小時后，收集病毒上清，同時加入 10 ml 預溫的 293T 培養(yǎng)基到細胞培養(yǎng)皿中。

將收集到的病毒上清存在 4 ℃ 冰箱中；收集 72 小時病毒上清，與 48 小時病毒上清混在一起。將離心機溫度降溫到 4 ℃，600 g，離心 5 分鐘，去除其中的細胞碎片，上清液經 0.45 μm 濾頭過濾，加入病毒濃縮液，配制濃縮病毒液。

將濃縮后的病毒放于 4 ℃ 冰箱搖床上，旋轉過夜。第二天，4 度離心機，3000~4000 g 離心 15 分鐘。棄掉上清液，加入 1Xpbs 或培養(yǎng)基重懸。

注意事項

1. 病毒包裝的幾個關鍵點主要包括：細胞因素、載體系統(tǒng)（盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng)）、構建重組的質粒正確與否、質粒抽提純化情況、包裝轉染控制（24、48 小時的細胞及熒光狀態(tài)判斷）、目的基因對病毒包裝影響 (基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會影響到是否能包裝成功）。

2. 293T 細胞狀態(tài)和鋪板時候的緊密會影響病毒包裝效率，需要觀察包裝病毒后的 48 h 培養(yǎng)基顏色是否橙紅。

3. 病毒濃縮：病毒一般在 48 h 和 72 h 各收一次。如果不想濃縮病毒的話，也可以直接將收集的病毒上清作為要感染的細胞的培養(yǎng)基，但是可能效果會不太好。并且一般收病毒時，培養(yǎng)基的營養(yǎng)已經損耗了很多，那樣直接培養(yǎng)感染細胞會損害細胞，所以建議還是進行濃縮后再感染。

常見問題

1. 包裝病毒時 293T 細胞狀態(tài)不好，或者鋪得過密，可以選擇放棄該次實驗。

2. 目的載體過大，不易感染。

3. 避免轉染過程以及后續(xù)感染過程出現(xiàn)的污染。