細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等是腫瘤研究的重要表型，是分子生物學(xué)和藥理學(xué)研究解決的問題之一。通過(guò)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或干擾某個(gè)基因研究基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響，進(jìn)一步研究基因的功能，或?qū)?xì)胞進(jìn)行藥物處理，研究藥物對(duì)增殖的影響。

1. MTT法：是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。該方法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、快捷。

原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

2. CCK-8法:可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析，常用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)。

原理：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

3. Brdu: 即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期，S期活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)加入。而后利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物雙重染色可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。

但由于抗體分子量大，難于摻入并被有效檢測(cè)。因此BrdU檢測(cè)需采用DNA酶或HCl或加熱使DNA變性。這些處理方法會(huì)破壞抗原識(shí)別位點(diǎn)，此外許多細(xì)胞周期分析的染料都需要dsDNA。這種處理方法也使得同一樣本無(wú)法同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。對(duì)于植物細(xì)胞等有細(xì)胞壁的分析。采用抗體檢測(cè)還需要消化細(xì)胞壁，細(xì)胞壁消化酶常含有一些雜質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的可靠性降低，同時(shí)BrdU檢測(cè)則需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的孵育--幾個(gè)小時(shí)甚至過(guò)夜。

4. EDU: 即5-Ethynyl-2’- deoxyuridine, 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶（T）滲入正在復(fù)制的DNA分子中。通過(guò)基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性，適用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)與發(fā)育、DNA修復(fù)、病毒復(fù)制、細(xì)胞標(biāo)記示蹤等方面的研究，尤其適合進(jìn)行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是腫瘤和發(fā)育研究的重點(diǎn)，同時(shí)也是藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自主結(jié)束其生命的過(guò)程。它是一個(gè)主動(dòng)的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過(guò)程。

細(xì)胞凋亡的過(guò)程大致可分為以下幾個(gè)階段：接受凋亡信號(hào)→凋亡調(diào)控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過(guò)程。

ANNEXIN V-PI法: 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin?V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin?V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。

將Annexin?V進(jìn)行熒光素（EGFP、FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin?V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium?Iodide,?PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin?V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。

細(xì)胞膜片鉗技術(shù)

膜片鉗技術(shù)被稱為研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”。是研究離子通道的最重要的技術(shù)。目前膜片鉗技術(shù)已從常規(guī)膜片鉗技術(shù)（Conventional patch clamp technique）發(fā)展到全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)（Automated patch clamp technique）

原理：膜片鉗技術(shù)是用微玻管電極（膜片電極或膜片吸管）接觸細(xì)胞膜，以千兆歐姆以上的阻抗使之封接，使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域（膜片）與其周圍在電學(xué)上分隔，在此基礎(chǔ)上固定點(diǎn)位，對(duì)此膜片上的離子通道的離子電流（pA級(jí)）進(jìn)行監(jiān)測(cè)記錄的方法。

用場(chǎng)效應(yīng)管運(yùn)算放大器構(gòu)成的I-V轉(zhuǎn)換器是測(cè)量回路的核心部分。在場(chǎng)效應(yīng)管運(yùn)算放大器的正負(fù)輸入端子為等電位，向正輸入端子施加指令電位時(shí)，由于短路負(fù)端子以及膜片都可等電位地達(dá)到鉗制的目的，當(dāng)膜片微電極尖端與默片之間形成10GΩ以上封接時(shí)，其間的分流電流達(dá)到最小，橫跨膜片的電流可100%作為來(lái)自膜片電極的記錄電流（lp）而被測(cè)量出來(lái)。

細(xì)胞遷移和侵襲

在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的能力是重要的研究對(duì)象。相關(guān)的信號(hào)通路主要可以分為控制細(xì)胞黏附和控制細(xì)胞骨架。細(xì)胞的遷移與侵襲主要與細(xì)胞骨架和黏附相關(guān)。腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的改變通常采用Transwell進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞劃痕也是測(cè)定腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性的方法，由于無(wú)法區(qū)別正常增殖和遷移細(xì)胞，應(yīng)用有局限性。

1.Transwell實(shí)驗(yàn)

Transwell小室底層的一張有通透性的膜（一般為聚碳酸酯膜），將其放置于孔板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞。應(yīng)用Transwell可研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。

腫瘤遷移實(shí)驗(yàn)：研究腫瘤細(xì)胞的遷移能力或特定情況下腫瘤細(xì)胞的遷移能力。常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)：研究腫瘤細(xì)胞的侵襲能力或特定情況下腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在聚碳酸酯膜上涂上一層基質(zhì)膠，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，細(xì)胞要把基質(zhì)消化后才可以從上室遷移到下室，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量測(cè)定細(xì)胞的侵襲能力。

?目的：研究目的基因過(guò)表達(dá)/干擾對(duì)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響

?材料：正常細(xì)胞、對(duì)照慢病毒、過(guò)表達(dá)基因慢病毒

?步驟：細(xì)胞復(fù)蘇——Transwell鋪板——細(xì)胞培養(yǎng)及染色——拍照

?結(jié)果：

2. 劃痕實(shí)驗(yàn)：

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移的原理：在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移能力。

實(shí)驗(yàn)通常需設(shè)定正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組是加了某種處理因素或藥物、外源性基因等的組別，通過(guò)不同分組之間的細(xì)胞對(duì)于劃痕區(qū)的修復(fù)能力，可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力。

細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞周期（cell cycle）是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度，單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。

原理：細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的 G0/G1期具有二倍體細(xì)胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI 即碘化丙錠，可以與細(xì)胞內(nèi)DNA 和RNA 結(jié)合，采用RNA酶將RNA消化后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與DNA 結(jié)合的PI 的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。

因此，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通過(guò)特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率。

?目的：通過(guò)慢病毒感染獲得基因過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株，利用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化。從而研究目的基因?qū)?xì)胞周期的影響。

?材料：目的細(xì)胞、病毒

?步驟：細(xì)胞準(zhǔn)備——樣品收集——上機(jī)檢測(cè)——數(shù)據(jù)分析

?結(jié)果：

細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)原理：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上（時(shí)間約1周以上），其后代所形成的細(xì)胞群體，稱為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50個(gè)以上的細(xì)胞，大小在0.3 - 1.0mm之間。

細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)， 但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖并形成克隆。只有同時(shí)具有貼壁和增殖活力的細(xì)胞才會(huì)形成克隆?？寺⌒纬陕史从臣?xì)胞的獨(dú)立生存能力的強(qiáng)弱，用于評(píng)價(jià)細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。

由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系，做克隆形成率測(cè)定時(shí)，接種細(xì)胞一定要分散成單細(xì)胞懸液，直接接種在培養(yǎng)皿中，持續(xù)一周以上，隨時(shí)檢查，到細(xì)胞形成克隆時(shí)終止培養(yǎng)。

?目的：通過(guò)目的基因過(guò)表達(dá)/干擾細(xì)胞組、空細(xì)胞組與陰性對(duì)照組(空病毒)克隆形成數(shù)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究基因?qū)?xì)胞群體依賴性和增殖能力的影響。

?材料：病毒和細(xì)胞株

?步驟：鋪板——細(xì)胞培養(yǎng)——觀察克隆，染色，計(jì)算克隆形成率

細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞黏附性是維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的基本條件，也是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和發(fā)揮功能的調(diào)節(jié)因素，并且對(duì)細(xì)胞的增殖、分化有重要影響。通常可分為兩類，即細(xì)胞與細(xì)胞黏附和細(xì)胞與基質(zhì)黏附。

機(jī)體內(nèi)許多細(xì)胞，如上皮細(xì)胞，需要牢固地定在某處發(fā)揮功能；另一些細(xì)胞，如白細(xì)胞，活躍運(yùn)動(dòng)，就需要不斷調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附。細(xì)胞黏附性的改變?cè)谀[瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。惡性腫瘤具有從原發(fā)瘤分離及在體內(nèi)擴(kuò)散的能力，提示這些細(xì)胞在相互識(shí)別及黏附機(jī)制方面發(fā)生了改變。

實(shí)驗(yàn)方法：

1、將4.5×105個(gè)Hep3B細(xì)胞/孔傳代于無(wú)菌6孔培養(yǎng)板中。

2、培養(yǎng)24h后，用Lipofectamine?TM?2000將37LRP?siRNA轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞（兩個(gè)平行孔，Lipofectamine?TM?2000轉(zhuǎn)染具體操作見方法7），轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后收集細(xì)胞。同時(shí)各有兩個(gè)平行孔的細(xì)胞進(jìn)行陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染及不行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染終濃度即siRNA終濃度為100nmol/L。

3、培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，用0.25%胰酶將貼壁培養(yǎng)細(xì)胞（約1×106個(gè)）從壁上消化下來(lái)并制成單細(xì)胞懸液。

4、用無(wú)血清MEM培養(yǎng)基將Matrigel配制成10ug/250ul（1:300）的人工基底膜膠備用。

5、96孔板每孔中鋪Matrigel?2ug/50ul，放于超凈臺(tái)中風(fēng)干過(guò)夜。