1 免疫印跡（western blot）灰度值（gray scale）計算實操

1.1 image J 分析灰度值

1.1.1 打開 image J；

（圖1 image J打開界面）

1.1.2 打開需要分析的圖片：“file- open- 找到圖片”；

（圖2打開需要分析圖片界面展示，此處展示的內(nèi)參β-ACTIN）

（圖3 western blot 圖片轉(zhuǎn)換為灰度圖設(shè)置）

1.1.4 將圖片背景灰度統(tǒng)一：“process- Subtract Background”，然后將“rolling ball radius，參數(shù)設(shè)置為50”，復(fù)選框選中l(wèi)ight background；此處的設(shè)置能夠消除背景的影響；

（圖4 圖片背景灰度統(tǒng)一設(shè)置）

（圖5 圖片背景灰度統(tǒng)一設(shè)置參數(shù)調(diào)整）

（圖6 完成灰度背景統(tǒng)一設(shè)置后圖片展示，可見背景顏色一致）

1.1.5 翻轉(zhuǎn)圖片的黑白：“edit- invert”；

（圖7 圖片黑白翻轉(zhuǎn)設(shè)置）

（圖8 圖片黑白翻轉(zhuǎn)后展示）

1.1.6 分析測量設(shè)置：“Analyze>Set Measurements，選擇Area面積、平均灰度值Mean gray value、極大小灰度值 min& max gray value、積分灰度值Integrated dendity”；

（圖9 測量參數(shù)設(shè)置命令操作）

（圖10 參量參數(shù)復(fù)選框設(shè)置）

1.1.7 將測量的單位設(shè)置為像素 pixels：“analyze- set scale”；

（圖11 測量單位定義為像素 pixels設(shè)置）

（圖12 設(shè)置為像素的相關(guān)設(shè)置，并定義到全部Global）

2.1 條帶的選擇和對應(yīng)光密度的測量：圖15紅色箭頭指向，分別表示舉行，橢圓、和不規(guī)則圖形，我一般比較喜歡用矩形選框；

（圖13 選擇條帶的框）

2.2 測量印記的灰度值，使用矩形/橢圓/不規(guī)則選框選擇需要測量的印記，然后使用快捷鍵（ctrl + M）或者菜單命令“analyze- measure”，盡量使用同一個框去測量所有灰度條帶（不是必須）；

（圖14 選中需要測量的印記條帶）

2.3 獲得對應(yīng)條帶數(shù)據(jù)；

（圖15 測量結(jié)果展示，紅框標記部分IntDen即為本次測量的光密度數(shù)值）

2.4 條帶數(shù)據(jù)的保存；

（圖16 數(shù)據(jù)導出設(shè)置）

（圖17 導出數(shù)據(jù)命名設(shè)置）

采用同樣的辦法，將目標蛋白的灰度值計算出來！

3 GraphPad軟件統(tǒng)計分析與作圖

3.1 首先使用excel對蛋白相對表達進行預(yù)處理，其中target protein 和 β-Actin的數(shù)據(jù)是通過image J測量獲得的灰度值值，而relative expression數(shù)值來自于target protein灰度值/β-Actin灰度值；

（圖18  Excle預(yù)處理數(shù)據(jù)示意圖）

3.2 打開GraphPad，選擇“column”，然后點擊create即可；

（圖19 創(chuàng)建GraphPad 柱狀圖column操作）

3.3 對新建的表格進行命名，左側(cè)紅框表示分析時間+分析內(nèi)容；右側(cè)紅框上邊是陰性組NC和處理組Treat，下邊對應(yīng)的數(shù)值是本次檢測蛋白相對表達的灰度值（GraphPad 轉(zhuǎn)置粘貼快捷鍵“ctrl + shift+ T”）；

（圖20 新建數(shù)據(jù)表格命名以及數(shù)據(jù)張貼）

3.4 數(shù)據(jù)分析“analyze”;

（圖21 數(shù)據(jù)統(tǒng)計選框）

3.5 統(tǒng)計方法的選擇，在此，因只有兩組數(shù)據(jù)，我們選擇 t test，然后點擊OK，即可；

（圖22 選擇 t test操作）

3.6 使用參數(shù)非配對t test，如圖中紅框所示；

（圖23 使用參數(shù)非配對t test）

3.7 統(tǒng)計結(jié)果解釋說明，P value表示統(tǒng)計差異（＜0.05即表示有統(tǒng)計學差異），P value summary這里的幾個星標可以用于后期作圖，一般用1-3顆星即可，significantly different是對P value的進一步說明；

（圖24 統(tǒng)計結(jié)果展示）

3.8 作圖，點擊左側(cè)Graphs對應(yīng)的統(tǒng)計表格名稱即可，后側(cè)是提供的圖片展示類型，一般差異較小的使用mean/median & error；誤差線 error bar 可選擇SD或者SEM

（圖25 數(shù)據(jù)作圖以及圖片展示類型選擇）

（圖26 圖片根據(jù)默認獲得的圖片展示）

3.9 圖片美化

3.9.1 首先將主要title和X title刪除，并對X-Y周進行命名；

（圖27 刪除多余title和X-Y軸命名后圖片展示）