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protocol 分享|瘤細(xì)胞皮下移植侵襲模型構(gòu)建

往先天性免疫缺陷的裸鼠皮下注射一定量的腫瘤細(xì)胞形成腫瘤,從而觀察腫瘤的發(fā)生發(fā)展情況以及藥物干擾情況等等。
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用途

常用于研究腫瘤細(xì)胞的成瘤能力、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、腫瘤細(xì)胞的耐藥和靶分子對腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展的影響等等。

材料與儀器

1、動物選購:一般選擇 6 周齡左右,體重為 18~22 g 的裸鼠,檢疫通過后,飼養(yǎng)于隔離屏障環(huán)境。

2、腫瘤細(xì)胞準(zhǔn)備:注意計算好細(xì)胞用量,細(xì)胞量一般為 5 × 106 個/200 μl(不同細(xì)胞系的接種量可能不同)。

3、耗材準(zhǔn)備:PBS×1、75% 酒精×1、濾紙×3 張、手套、器械盒(主要有彎剪、鑷子、1 ml 注射器和止血夾)、棉球等。

步驟

1、腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增:

(a)取腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇并擴(kuò)增,用 0.25% 胰酶消化,1 000 rpm 離心。

(b)去除上清,加入 1×PBS 將細(xì)胞洗一遍,再加入 1×PBS 重懸,計數(shù),按比例稀釋細(xì)胞懸液,調(diào)整為約 5 × 106 個/200 μl 的細(xì)胞懸液。

(c)用無血清的培養(yǎng)基吹勻離心兩遍,再用無血清的培基重懸混勻,置于 0.5 ml 的 EP 管中,冰上備用(考慮到細(xì)胞活性,應(yīng)盡快注射到裸鼠皮下)。

2、成瘤過程:

(a)根據(jù)實驗要求分組,每組小鼠至少 5 只以上。

(b)抓取時用大拇指和食指抓住裸鼠的整個背部和頭部,無名指和小指壓住小腿和尾巴。棉球蘸取酒精后擦拭注射部位(背部或腋下)。用 1 ml 注射器(選擇常規(guī) 1 ml 注射器即可)吸取 200 μl 細(xì)胞懸液,注射至裸鼠表皮下。

3、成瘤后:

(a)注射瘤細(xì)胞后通常在 3 天后肉眼觀察,并在每次觀察時都記錄裸鼠的體重。

(b)成瘤之后需要定時用標(biāo)尺記錄腫瘤的長軸和短軸變化,并記錄統(tǒng)計。

(c)根據(jù)實驗要求,達(dá)到時間后頸椎脫臼處死裸鼠,取出腫瘤,拍照記錄。拍照時注意光線,對焦清楚。

(d)計算腫瘤體積公式為:長軸×寬軸 2/2。

注意事項

(a)細(xì)胞在大量擴(kuò)增時為了保證細(xì)胞的活性,可以適當(dāng)增加血清和抗生素濃度。

(b)皮下注射成功的標(biāo)準(zhǔn):皮下注射形成可以推動的明顯突起(參考水痘)。

(c)皮下注射瘤細(xì)胞懸液后停留幾秒再拔出針頭,以防止懸液隨針頭滲漏。

(d)注射成瘤后的小鼠容易死亡,注意實驗周期。

(e)可以先進(jìn)行各 3 只分組的預(yù)實驗,如果在裸鼠中實在無法成瘤,可以選擇其他免疫缺陷型,如 NOG、SCID 等小鼠。

(f)裸鼠成瘤由于存在個體差異,可能無法成瘤,所以在分組時盡量多,或成瘤后再進(jìn)行隨機(jī)分組。

(g)提高細(xì)胞的濃度能夠提高成瘤速度,但這個范圍并不固定,難以把握。