RNA 提取試劑（Trizol）

發(fā)布日期：2019-09-10 瀏覽次數(shù)：617

產(chǎn)品組分
 

 
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
       該產(chǎn)品是一種即用型，適用于細(xì)胞或組織總 RNA 提取的含有指示劑的試劑。該產(chǎn)品的作用原理采用與 Invitrogen 公司的 TRIzol 相似的原理和方法，主要成分為苯酚和異硫氰酸胍等，提取步驟和方法也相同。指示劑的顏色也與 TRIzol 的顏色一致，加入氯仿后離心分層，形成上清層、中間層和有機(jī)層，上層水相（含 RNA）呈無色，下層有機(jī)相呈紫紅色。RNA 經(jīng)異丙醇沉淀便可得到總 RNA。該產(chǎn)品具有極強(qiáng)的裂解能力，可以短時(shí)間內(nèi)裂解細(xì)胞和組織樣本，并有效**樣本中 RNA 的降解，保持RNA 的完整性。提取的RNA 可直接用于多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，比如RT-PCR， Northern blot，體外翻譯、cDNA 克隆、RNase 保護(hù)實(shí)驗(yàn)以及高通量測(cè)序等對(duì) RNA 質(zhì)量要求較高的情況。

使用注意事項(xiàng)

1、本產(chǎn)品中含有苯酚，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內(nèi)、接觸皮膚、吞食等會(huì)引起中毒、灼傷及其他身體傷害。使用時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)服裝、手套、面罩等防護(hù)物。如果不小心接觸到眼睛時(shí)，應(yīng)立即用大量水沖洗然后前往醫(yī)院進(jìn)行**。
2、請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，避免 RNase 污染。
3、使用 RNase-free 的塑料制品和*頭避免交叉污染；所有離心管及相關(guān)溶液都必須無 RNA 酶污染。
4、請(qǐng)自備氯仿、異丙醇（新開封或提取 RNA **）、75%乙醇（DEPC 處理水配制）、DEPC 和 DEPC 處理水。
5、使用凍存的細(xì)胞或組織抽提總 RNA 的效果通常會(huì)比新鮮的細(xì)胞或組織差一些，因?yàn)閮龃孢^程中細(xì)胞或組織內(nèi)的 RNase 會(huì)被釋放出來并剪切樣品。推薦：如果不能及時(shí)抽提 RNA，先加入適量 Trizol 試劑，裂解樣品然后再凍存，這樣 RNase 就不會(huì)降解樣品。

6、樣品勻漿后，加入氯仿前，可在-80°C 凍存放置一個(gè)月。
7、RNA 沉淀可以保存在 75%乙醇中，2-8°C 放置一周或-20°C 放置一年。
8、該試劑盒**于專業(yè)人員的科學(xué)研究使用，不得用于臨床診斷或**，更不得用于食品或藥品中。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、細(xì)胞裂解或組織勻漿：
          a. 貼壁細(xì)胞：吸盡培液，按照比例加入 Trizol 消化細(xì)胞，即每 10 平方厘米細(xì)胞中加入 1 ml Trizol，六孔板每孔加 1 ml Trizol，12 孔板每孔加 0.5 ml Trizol。晃動(dòng) 3-5 下，再用移液器反復(fù)吹打幾下，確保細(xì)胞全部裂解，然后將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中?！咀ⅰ考尤?span> Trizol 量不足時(shí)，會(huì)導(dǎo)致 DNA 污染。
          b. 懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，每5×10⁶-1×10⁷ 個(gè)細(xì)胞加入1ml Trizol， 再用移液器反復(fù)吹打?！咀ⅰ考尤?span> Trizol 前應(yīng)避免洗滌細(xì)胞，會(huì)增加 mRNA 降解的可能性。
          c. 動(dòng)、植物組織：取-80°C 凍存的組織在液氮中充分研磨后加入適量的Trizol混勻；或者取新鮮動(dòng)物或植物組織盡量剪碎，然后加入適量的 Trizol 進(jìn)行勻漿處理。
2、將勻漿樣品劇烈震蕩后在室溫條件下放置 5 分鐘以使**白體完全裂解?！咀ⅰ看瞬讲荒苁÷裕瑫r(shí)間可以長(zhǎng)于 5 分鐘。
3、（可選步驟）4°C，12000rpm 離心 10 分鐘，取上清。【注】如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖等可離心除去。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜、多糖、高分子量的 DNA 等物質(zhì)，上清中含有 RNA。處理脂肪組織樣品時(shí)，上層是大量油脂， 應(yīng)除去，然后再取澄清的勻漿溶液進(jìn)行下一步的操作。
4、每毫升 Trizol 加入 0.2ml 氯仿，Vortex 混勻或猛烈晃動(dòng) 15 秒，室溫放置 3分鐘。
5、4°C，12000rpm 離心 15 分鐘，樣品會(huì)分成三層：上層無色的水相、中間蛋白層和紫紅色的下層有機(jī)相。然后吸取含總 RNA 的上層無色水相至一新的RNase-free 的離心管中。

6、按照每毫升*初的 Trizol 加入 0.5 ml  異丙醇的比例，顛倒數(shù)次混勻，室溫沉淀 10 分鐘，或者-20°C 沉淀 30 分鐘，或-70°C 沉淀過夜?！咀ⅰ咳绻Ｍ崛?span>microRNA 等小 RNA 時(shí)，推薦使用低溫長(zhǎng)時(shí)間的沉淀，來獲得**效果。
7、4°C，12000rpm 離心 10 分鐘，在管底可見 RNA 沉淀，棄上清?！咀ⅰ考兌仍胶玫?span> RNA 沉淀會(huì)在管側(cè)和管底形成透明膠質(zhì)狀，不容易看清楚。
8、按照每毫升*初的 Trizol 加入 1 ml 75%乙醇（DEPC 水配制）的比例，Vortex混勻或顛倒混勻，讓沉淀懸浮起來以充分洗滌沉淀中的鹽分。
9、4°C，12000rpm 離心 5 分鐘，棄上清。剩余的少量液體再用離心機(jī)瞬甩一下， 徹底去掉上清液。注意不要吸到沉淀，否則會(huì)造成 RNA 損失。
10、室溫放置空氣干燥 5-10 分鐘，待 RNA 沉淀略干后，加入適量（約 20-100μl）的 RNase-free 水溶解 RNA 沉淀，-80°C 凍存?！咀ⅰ壳形鹱?span> RNA 徹底干燥，否則將導(dǎo)致 RNA 溶解度降低。

產(chǎn)物檢測(cè)

1、RNA 完整性檢測(cè)
        取 1 μl RNA 加入適當(dāng) RNA loading buffer，混勻，進(jìn)行電泳檢測(cè)。若出現(xiàn)清晰的三條帶，分別為 28S、18S 和 5S，且條帶之間界限清晰，就證明 RNA 樣品的完整性非常好?？蓞⒖家韵聢D示：

2、RNA 純度檢測(cè)

     利用分光光度計(jì)或者NanoDrop 儀檢測(cè)RNA 樣品在260nm、280nm 處的OD 值， 并計(jì)算 A260/A280 的比值。純的 RNA 的比值應(yīng)在 2.0 左右。

常見問題分析

1、提取到的 RNA 得率很低。

可能的原因如下：
1、樣品裂解或勻漿處理不徹底。
2、RNA 沉淀?xiàng)l件和時(shí)間太短，沒有充分沉淀 RNA 造成 RNA 損失。
3、**得到的 RNA 沉淀未完全溶解。

2、RNA 降解

可能的原因如下：
1、組織取出后沒有馬上進(jìn)行處理或冷凍，導(dǎo)致 RNase 的釋放降解樣品中的RNA。
2、貼壁細(xì)胞在胰蛋白酶處理時(shí)被破壞。
3、樣本量太大而加入的 Trizol 液少，導(dǎo)致裂解不完全，不能有效** RNase的活性，進(jìn)而導(dǎo)致 RNA 降解。
4、提取過程中使用的溶液、離心管或*頭未經(jīng) RNase 去除處理。
5、RNA 沉淀沒有保存于-80°C。
6、RNA 電泳時(shí)的電泳液及電泳槽中含有 RNase，或者電泳時(shí)電泳液溫度過高， 造成 RNA 樣品被降解。

3、蛋白和多糖污染

可能的原因如下：
1、樣品中蛋白和多糖含量高，建議加入氯仿之前先高速離心去除蛋白和多糖。
2、吸取上層無色水相時(shí)不小心吸入一些中間蛋白層的物質(zhì)，建議將移液*頭中的液體放回分層的離心管中，重新進(jìn)行離心后再小心吸取上層水相即可。
3、樣品量太大，裂解不完全也會(huì)導(dǎo)致 RNA 樣品中蛋白和多糖污染。

4、A260/A280 的比值低于 1.65
可能的原因如下：

1、RNA 樣品溶于 TE 溶液，低離子濃度和低 pH 條件下，A280 的數(shù)值會(huì)較高， 導(dǎo)致比值低。
2、樣品勻漿時(shí)加的 Trizol 試劑量太少。
3、勻漿后樣品未在室溫放置 5 分鐘，會(huì)導(dǎo)致蛋白的析出不完全，也會(huì)增加 A280的數(shù)值。
4、**得到的 RNA 沉淀溶解不完全。

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