兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離培養(yǎng)
【簡介】
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,對骨髓中的造血干細(xì)胞(HSC)不僅有機(jī)械支持作用,還能分泌多種生長因子(如IL-6,IL-11,LIF,M-CSF及SCF等)來支持造血。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潛能,能促進(jìn)間充質(zhì)組織的再生,如:骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質(zhì)等組織;
【材料】
超凈臺、PBS、廢液桶、75%酒精、手術(shù)包、percoll分離液、培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶等;
【方法】
1)兔處死后, 放入75% 的酒精內(nèi)浸泡15 min,無菌條件下取出雙側(cè)股骨、脛骨、肱骨,去除附帶組織,浸入生理鹽水中清洗2次;
2)鑷子和剪刀分離出股骨和脛骨,剔除骨頭表面肌肉,PBS溶液沖洗兩遍,酒精棉布擦拭,清理干凈外骨骼,移入6cm培養(yǎng)皿;
3)培養(yǎng)液浸泡,剪掉頭尾,露出骨髓腔用無菌注射器抽取含10%FBS的L-DMEM針頭刺穿沖洗骨髓腔;
4)用培養(yǎng)液進(jìn)行反復(fù)吹打,制備骨髓單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管,1000?r/min離心3min,棄上清、脂肪層,重復(fù)離心1次;
5)細(xì)胞沉淀加入4ml含10%FBS的L-DMEM重懸細(xì)胞,使用Percoll梯度分離;
注:Percoll調(diào)整為1.073濃度,4ml細(xì)胞懸液加入含5ml分離液的離心管;
6)2000RPM/20min,取中間渾濁單核細(xì)胞層,PBS兩倍稀釋后懸液1000RPM/3min,棄上清,10%FBS的L-DMEM重懸細(xì)胞,移入10cm Dish,37°、5%CO2培養(yǎng);
7)24h后換液(視細(xì)胞貼壁情況),之后3天換一次液;
【培養(yǎng)】
干細(xì)胞專用培養(yǎng)液
【鑒定】
四、鑒定
1)流式細(xì)胞鑒定:
陽性:CD29、CD90、CD44、CD105、CD166;
陰性:CD34、CD45、CD80、CD86;