實驗技巧 | 血管生成實驗—腫瘤項目必做實驗之一

為什么要做血管生成實驗？血管生長是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟。無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2mm，都會有血管生成，這是由于腫瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導血管生成。上海東寰與您一起分享。

血管生長是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟。無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2mm，都會有血管生成，這是由于腫瘤細胞自身可分泌多種生長因子，誘導血管生成。

由于腫瘤組織這種新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常，且血管基質(zhì)不完善，這種微血管容易發(fā)生滲漏，因此腫瘤細胞不需經(jīng)過復雜的侵襲過程而直接穿透到血管內(nèi)進入血流并在遠隔部位形成轉(zhuǎn)移。越來越多的研究表明，良性腫瘤血管生成稀少，血管生長緩慢；而大多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速，因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴散轉(zhuǎn)移。

血管生成實驗的技術(shù)原理主要是應(yīng)用Matrigel模擬機體環(huán)境，上面接種腫瘤細胞，觀察血管生成情況。

體外的血管生成實驗?zāi)芎芎玫哪M腫瘤的血管發(fā)生過程，并且適合研究藥物對這一過程的影響實驗。我們以HUVEC細胞為例，介紹這一實驗的詳細過程。

1、主要步驟

Step1：細胞培養(yǎng)

Step2：細胞轉(zhuǎn)染或藥物處理

Step3：鋪Matrigel膠

Step4：接種細胞

Step5：觀察血管生成情況

實驗過程中需要注意：

1、實驗前一天需要將Matrigel置于冰盒，放入冰箱中，同時需要準備一些預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel膠；

2、將Matrigel膠加到血管生成載玻片時注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠；

3、需要按照細胞的生長速度定時采集圖像，并且對其成管長度、覆蓋面積、成環(huán)數(shù)和結(jié)點進行測量和記錄，并且對其進行統(tǒng)計分析；

4、分上下孔的ibidi血管生成載玻片能去除凹液面，使成像效果更好。

（Matrigel鋪在下孔，細胞鋪在Matrigel上，上孔充滿培養(yǎng)基）

2、數(shù)據(jù)分析

（在特定的時間點采集圖片，并且進行圖像分析（Wimasis全自動分析）測量小管長度，成環(huán)數(shù)，細胞覆蓋面積和結(jié)點。之后在對測量結(jié)果進行統(tǒng)計分析以說明實驗結(jié)果。）

三、實驗具體步驟

1、準備基質(zhì)膠

1）實驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4度冰箱，使膠能過夜緩慢融化。（注意：同樣要準備一些4攝氏度預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）。

2）開始實驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。

3）打開滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。

4）每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。由于Matrigel流動性不強，并且有可能移液槍不準確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會影響到實驗的成像結(jié)果。

如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：

我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

2、凝膠

1）蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

2）準備一個10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。

3）將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。

4）將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。

5）等待同時準備細胞懸液。

3. 鋪細胞

加入細胞的量直接影響實驗結(jié)果，所以在正式實驗開始之前，要對不同類型的細胞和使用數(shù)量進行預(yù)實驗。獲得最佳比例的細胞密度。我們今天的實驗使用HUVEC細胞，每孔種10000個細胞即可。

1）準備密度為2×105的細胞懸液，充分混勻。