大鼠耳軟骨細(xì)胞細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定
【簡(jiǎn)介】
軟骨細(xì)胞位于軟骨組織的表層,單個(gè)分布,體積較小,呈橢圓形,長(zhǎng)軸與軟骨表面平行,越向深層的軟骨細(xì)胞體積之間增大呈圓形,細(xì)胞核圓形或卵圓形,染色淺,細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性,常見數(shù)量不一的脂滴。
【材料】
手術(shù)剪、手術(shù)鑷、75%酒精、PBS、雙抗、FBS、培養(yǎng)皿、15ml離心管、II型膠原酶、胰蛋白酶。
【方法】
1)將耳軟骨收集在PBS中反復(fù)清洗,剪成lmm×1mm×1mm左右的組織塊 ,轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中。
2)加入0.25%胰蛋白酶消化30min反復(fù)洗滌、離心。
3)加入2mg/mlII型膠原酶溶液置于37℃水浴中輕微振蕩消化 ,直至軟骨組織塊基本消失、溶液變混濁為止,一般需 6~8h。
4)剩下未消化的組織用1mg/mlII型膠原酶37℃震蕩消化過液,一般需要16~18個(gè)小時(shí)。
【培養(yǎng)】
軟骨細(xì)胞專用培養(yǎng)液:DMEM/F12活性成分:1%ITS、20ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、5-10%胎牛血清(FBS)、40μg/mL維生素C(L-抗壞血酸)。
【鑒定】
1)免疫熒光鑒定
II型膠原蛋白抗體(Collagen II)。