【簡介】
小膠質(zhì)細(xì)胞是調(diào)節(jié)大腦發(fā)育、維持神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和損傷修復(fù)的大腦常駐細(xì)胞,在大腦正常發(fā)育過程中起著不可或缺的作用,對腦組織尤其是神經(jīng)元起著營養(yǎng)、支持、保護(hù)、監(jiān)視等作用并能根據(jù)微環(huán)境的不同向不同方向發(fā)展;小膠質(zhì)細(xì)胞對維持大腦的穩(wěn)態(tài)及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸傳遞、神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及新陳代謝等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種正常生理活動以及神經(jīng)疾病的病理機(jī)制中都起著十分重要的作用;
【材料】
一)器械滅菌:
手術(shù)器械: 2把眼科直剪,2把彎鑷、2支左右1.5mL離心管、6cm或10cm Dish;
二)溶液準(zhǔn)備:
DMEM/F12培養(yǎng)基、雙抗PBS、75%的酒精、FBS、胰酶;
【方法】
1)3只新生1~2d大鼠75%酒精消毒后, 無菌條件下開顱取出腦組織,放在提前預(yù)冷的D-Hanks液中剝離血管與腦膜并去除所有出血點,將皮質(zhì)和海馬移到呈有D-Hanks液的 15 mL 離心管中;
2)用 1 mL 移液槍輕輕吹打數(shù)下加入0.25%胰酶并輕輕吹打混勻,而后將離心管放入37℃中3min,待液體呈流水狀,基終止消化;
3)終止后的液體通過70μm細(xì)胞篩過濾,收集過濾后的液體并1000 r/min,5 min離心;
4)DMEM/F12清洗2次后細(xì)胞種盤,24小時第一次換液,第5天再換液,培養(yǎng)第 8 天時,細(xì)胞明顯分層生長,用10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基換液;
5)第9天,將培養(yǎng)基從培養(yǎng)瓶中移到離心管中放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),再將新的10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基注入培養(yǎng)瓶,置于37 ℃恒溫?fù)u床(200 r/min)震搖2 h,收集散落細(xì)胞,直接接種至培養(yǎng)瓶或孔板中,同時在原混合培養(yǎng)瓶中加入20%FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5d后可收獲第2批小膠質(zhì)細(xì)胞;采用差速貼壁25 min后倒掉新孔板中的培養(yǎng)基,將提前準(zhǔn)備好的第8天換液培養(yǎng)基離心后加入養(yǎng)瓶或孔板中,24h后全換液;
【培養(yǎng)】
DMEM/F12完全培養(yǎng)基
【鑒定】
1)免疫熒光:
陽性:Iba1