兔腎小管上皮細(xì)胞原代分離培養(yǎng)

【簡介】

腎小管上皮細(xì)胞是腎小管間質(zhì)的主要細(xì)胞，它具有非常旺盛的代謝活性和潛在的增殖能力，并且能夠分泌多種細(xì)胞因子，所以，腎小管上皮細(xì)胞損傷，是引起急性腎衰竭的直接原因。腎小管上皮細(xì)胞來自于腎立方上皮細(xì)胞，比中性粒細(xì)胞要大，核比較大、呈圓形，核膜較厚，核突出容易見。在尿液中容易變形，大多呈圓形或多邊形，所以又稱多邊細(xì)胞；

【材料】

75%酒精、雙抗PBS、含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液、0.1%Ⅳ型膠原酶、0.05%胰蛋白酶、剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿；

【方法】

1）兔處死后75%酒精浸泡3min，開腹腔取腎臟置于預(yù)冷的PBS中，去除外膜，將腎皮質(zhì)剪碎至1mm³大小,洗去血液及尿液；

2）組織沉淀1：3比例加胰酶和Ⅳ型膠原酶混合37°消化20min, 靜置2min取上清，未消化組織加消化液繼續(xù)消化20min，靜置后取上清，重復(fù)至無組織；

3）上清加含血清培液稀釋后經(jīng)100目（150-165um）篩網(wǎng)、200目（70-75um）篩網(wǎng)過濾,收集200目篩網(wǎng)上物,1300R/5min離心后去上清；

4）重懸沉淀600R/3min離心兩次棄上清，純化腎小管；

5)加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)48h首次換液，后面2d換液一次；

【培養(yǎng)】

上皮專用培養(yǎng)液

【鑒定】

陽性：細(xì)胞角蛋白18（Cytokeratin 18）、ZO-1、腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白Villin、AQP1和SGLT2，采用細(xì)胞角蛋白18（Cytokeratin 18）；

陰性：波形蛋白Vimentin；