小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

【簡(jiǎn)介】

長(zhǎng)突起的細(xì)胞，它由細(xì)胞體和細(xì)胞突起構(gòu)成,細(xì)胞體位于腦、脊髓和神經(jīng)節(jié)中，細(xì)胞突起可延伸至全身各器官和組織中,細(xì)胞體是細(xì)胞含核的部分，其形狀大小有很大差別，直徑約4～120微米,核大而圓，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)少，核仁明顯,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有斑塊狀的核外染色質(zhì)（舊稱尼爾小體），還有許多神經(jīng)元纖維,細(xì)胞突起是由細(xì)胞體延伸出來的細(xì)長(zhǎng)部分，又可分為樹突和軸突,每個(gè)神經(jīng)元可以有一或多個(gè)樹突，可以接受刺激并將興奮傳入細(xì)胞體,每個(gè)神經(jīng)元只有一個(gè)軸突，可以把興奮從胞體傳送到另一個(gè)神經(jīng)元或其他組織，如肌肉或腺體。

【材料】

1d出生小鼠、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、75%酒精、雙抗PBS、FBS、培養(yǎng)皿、15ml離心管、胰蛋白酶、DMEM/F12、神經(jīng)細(xì)胞專用培養(yǎng)液；

【方法】

1包被:培養(yǎng)前一天將培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶或皿用0.01%多聚賴氨酸包被過夜,第二天早上來吸除包被液在無菌超凈臺(tái)中自然晾干后放置于培養(yǎng)箱中備用;

2配制神經(jīng)元專用培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1%谷氨酰胺,2% B27,1%雙抗)

3取腦:選取新生24h之內(nèi)的小鼠，數(shù)只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,斷頭處死,無菌條件下分層剪開頭皮,顱骨,用彎鑷?yán)_腦區(qū)視野,小心取出全腦,用預(yù)冷的PBS洗數(shù)次;

4分離:以腦中線為起點(diǎn),小心撥開大腦顳葉皮層,暴露出新月狀海馬回,小心夾出海馬組織,置于預(yù)冷的PBS中,仔細(xì)剔除微血管,用眼科剪充分剪碎組織。

5消化:加入同體積0.125%的胰蛋白酶,放入培養(yǎng)箱中消化30分鐘,期間每隔5分鐘輕搖一下;

6過濾:加入數(shù)滴胎牛血清終止消化,用吸管輕輕吹打細(xì)胞數(shù)分鐘,至液體成米糊狀即停止吹打,動(dòng)作務(wù)必輕柔,用200目細(xì)胞篩過濾收集細(xì)胞懸液。

7接種:300rpm離心5分鐘,去除上清,用DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,輕輕吹打,調(diào)整細(xì)胞濃度接種;

8換液:6小時(shí)后將DMEM/F12完全培養(yǎng)液全量換成神經(jīng)元專用培養(yǎng)液,第48小時(shí)后加入一定濃度的阿糖胞苷,以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞過度生長(zhǎng),隨后每3天半量換液;

【培養(yǎng)】

神經(jīng)細(xì)胞專用培養(yǎng)液:DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1%谷氨酰胺,2% B27,1%雙抗;

【鑒定】

1.形態(tài)學(xué)的觀察:可以很清楚的看到神經(jīng)元特有的形態(tài)，軸突樹突以及胞體非常明顯;
2.免疫學(xué)鑒定：NF（神經(jīng)絲）或者tubulin陽性表達(dá);