兔成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定

【簡介】

成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌，并促進(jìn)基質(zhì)礦化形成骨組織；骨不斷地進(jìn)行著重建，骨重建過程包括破骨細(xì)胞貼附在舊骨區(qū)域，分泌酸性物質(zhì)溶解礦物質(zhì)，分泌蛋白酶消化骨基質(zhì)，形成骨吸收陷窩；其后，成骨細(xì)胞移行至被吸收部位，分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)礦化而形成新骨；

【材料】

3-8周齡兔、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、75%酒精、雙抗PBS、DMEM/F12、FBS、培養(yǎng)皿、15ml離心管、胰蛋白酶；

【方法】

1）取手術(shù)切除的骨膜，放入盛有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，去除附著于骨膜上的結(jié)締組織，將骨膜剪碎成1～2 mm2大小的組織塊；

2）加入0.1 % EDTA與0.25％胰蛋白酶混合消化液，置于37℃條件下消化20～30分鐘，進(jìn)行1000r/min離心1～2分鐘，沉淀骨膜組織塊，棄去上清液，用PBS緩沖液洗滌沉淀骨膜組織塊2～3次，重復(fù)上述離心（1000r/min離心1～2分鐘）過程，37℃條件下再用1mg/ml I型膠原酶消化骨膜組織塊約90分鐘，進(jìn)行1000r/min離心5～10分鐘以沉淀細(xì)胞，棄去消化液；

3）用培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞沉淀1～2次，離心（1000r/min離心10分鐘）收集細(xì)胞；

【培養(yǎng)】

軟骨專用細(xì)胞培養(yǎng)液

【鑒定】

堿性磷酸酶染色 (AKP)