兔骨髓來源內(nèi)皮祖細胞（EPCs）的分離培養(yǎng)及鑒定

【簡介】

EPCs是一群具有游走特性，能自我更新、增殖分化為內(nèi)皮細胞的多能干細胞，具有遲發(fā)性高增殖潛能及定向歸巢特性。它與血管新生、心血管組織工程內(nèi)皮化等關(guān)系密切，在基礎(chǔ)研究、肢體缺血性疾病及心血管疾病等領(lǐng)域有關(guān)EPC的研究非?；钴S，從而為治療缺血性疾病、血管組織工程及腫瘤治療提供了新的思路和手段；

【材料】

3-8周齡兔、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、75%酒精、雙抗PBS、Percoll淋巴細胞分離液、M199、FBS、培養(yǎng)皿、15ml離心管、10μg/ ml人纖連蛋白包被蓋玻片；

【方法】

1）脫頸處死，75%酒精浸泡5min，將股骨、脛骨迅速從小鼠中剝離下來，置于平皿中PBS浸泡，去除表面肌肉，PBS清洗干凈；

2）骨頭移入新皿剪開兩端，培液沖洗骨腔，吹打混勻，1000R/5min，棄上清，培液重懸；

3）懸液緩慢加入預(yù)先裝有等量體積Percoll（1.083g/ml）離心管中2500R/30min（也有2300R/20min，2000R/20min）；

4）收集離心后中間云霧狀白膜層單個核細胞，培液洗滌兩次，1000R/5-8min，棄上清；

5）含10%FBS的專用培養(yǎng)液重懸，37°培養(yǎng)，24h后將含有未貼壁細胞的上清液轉(zhuǎn)入新皿培養(yǎng)，2-3d首換液，之后每3d換液一次（注：24h取上清重新貼壁培養(yǎng)和不取上清一直培養(yǎng)后的細胞做鑒定都是EPC細胞）；

【培養(yǎng)】

內(nèi)皮專用培養(yǎng)液：10%FBS、M199（50ug/ml ECGS）、b-FGF（20ng/ ml）、VEGF（10-20ng/ml）、肝素鈉（10ug/ml）；

【鑒定】

1）免疫熒光陽性：

造血干/祖細胞標(biāo)志（CD133、CD34）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR-2）、血管性血友病因子（vWF）；